超連續譜激光器(qi)用于光片熒光顯微鏡

光片熒光顯微鏡的優點

光片熒光顯(xian)微(wei)鏡(jing)（LSFM）是(shi)(shi)一(yi)(yi)種可以對活體標本進(jin)行快(kuai)速(su)且無光毒性3D觀(guan)測的(de)(de)強(qiang)大顯(xian)微(wei)成像(xiang)技(ji)術。LSFM技(ji)術將寬場成像(xiang)的(de)(de)速(su)度(du)與適度(du)的(de)(de)光學切片和低光漂白(bai)特(te)點相(xiang)結合，因(yin)此也(ye)被稱為(wei)選擇性平(ping)面照明(ming)顯(xian)微(wei)鏡(jing)（SPIM），或簡稱為(wei)“光片"。SPIM或LSFM共(gong)同的(de)(de)定義特(te)征是(shi)(shi)從側(ce)面對焦(jiao)平(ping)面進(jin)行平(ping)面照明(ming)，在任何給定時間(jian)，僅對樣品的(de)(de)一(yi)(yi)小部(bu)分進(jin)行照明(ming)，因(yin)此與寬場輻(fu)射(she)熒光相(xiang)比，可以最 大限度(du)地減(jian)少(shao)光損傷(shang)并提供(gong)改(gai)善信(xin)噪比的(de)(de)光學切片。此外由(you)于(yu)圖(tu)像(xiang)是(shi)(shi)以寬場（2D平(ping)行）方式(shi)收集(ji)的(de)(de)，因(yin)此光片成像(xiang)比一(yi)(yi)次(ci)僅檢測一(yi)(yi)個像(xiang)素的(de)(de)點掃描共(gong)聚焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)快(kuai)得多。

由于三個(ge)關鍵特性，光片(pian)熒光顯微(wei)鏡正(zheng)成(cheng)為體積成(cheng)像zui流 行的技術之一：

1.激(ji)發點(dian)被(bei)限制在焦平面(mian)附(fu)近，光損傷被(bei)最(zui) 小化，生(sheng)物可以存活更長的時間；

2.容易獲(huo)得良(liang)好(hao)的光學切片，通常(chang)接近共聚焦顯(xian)微(wei)鏡；

3.采集速度非常快，比傳統的共聚焦顯(xian)微鏡快幾個(ge)數量級。

從本質上(shang)講，光(guang)片(pian)顯(xian)微鏡通(tong)常(chang)基于熒(ying)光(guang)技術，一般(ban)來(lai)說，研究中(zhong)的(de)(de)(de)樣(yang)品需要(yao)正確標記(ji)才(cai)能成(cheng)像(xiang)。使(shi)用(yong)彈性散(san)射(she)光(guang)可以生成(cheng)未標記(ji)樣(yang)本的(de)(de)(de)圖像(xiang)，但目前主要(yao)的(de)(de)(de)障礙是這些圖像(xiang)通(tong)常(chang)受到散(san)斑的(de)(de)(de)影響。為(wei)了解決這個不(bu)便，Pablo Loza-Alvarez, Omar Alarte, David Merino of ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques with Diego Battista and Giannis Zacharakis of Foundation for Research and Technology-Hellas使(shi)用(yong)來(lai)自(zi)樣(yang)本的(de)(de)(de)彈性散(san)射(she)光(guang)來(lai)生成(cheng)圖像(xiang)，以避免(mian)對樣(yang)品的(de)(de)(de)標記(ji)。他們使(shi)用(yong)了低(di)時間相干的(de)(de)(de)超連(lian)續譜激光(guang)光(guang)源(yuan)作(zuo)為(wei)一種候選光(guang)源(yuan)，以減(jian)少散(san)射(she)光(guang)在光(guang)片(pian)顯(xian)微鏡圖像(xiang)中(zhong)固有的(de)(de)(de)散(san)斑。

在這(zhe)項(xiang)工作中，他們提出了一種基于光片的(de)新型光學裝置，該(gai)裝置采用了三種方法來(lai)處理彈性散射圖像帶來(lai)的(de)散斑，分(fen)別是偏振濾(lv)波、降(jiang)低激發光源的(de)時(shi)間(jian)相干性和降(jiang)低光片的(de)空間(jian)相干性，這(zhe)些策略可以在不(bu)依賴熒光標記的(de)前提下使具(ju)有挑戰性的(de)生物(wu)樣品(pin)結構特征(zheng)的(de)原始光片彈性散射成像成為可能。

光片顯微鏡(jing)中的偏振(zhen)和相(xiang)干控(kong)制

在該實驗中，彈性散射光(guang)片(pian)顯微鏡(jing)的(de)(de)(de)主要部件是(shi)來(lai)自西班牙(ya)FYLA公司的(de)(de)(de)超連續譜(pu)光(guang)纖激(ji)光(guang)器，它發出從可(ke)見光(guang)到(dao)紅(hong)外光(guang)的(de)(de)(de)寬帶(dai)光(guang)譜(pu)。該光(guang)源(yuan)具有非常寬的(de)(de)(de)光(guang)譜(pu)帶(dai)寬，同時，它呈(cheng)現出非常低的(de)(de)(de)時間相干性，這對(dui)于減(jian)少(shao)圖像中的(de)(de)(de)散斑(ban)效(xiao)應都是(shi)非常重要的(de)(de)(de)。對(dui)FYLA白色激(ji)光(guang)選擇500至700nm（140nm FWHM）的(de)(de)(de)波段用于光(guang)片(pian)熒光(guang)顯微鏡(jing)，可(ke)以提供較低的(de)(de)(de)時間相干性以降低散斑(ban)對(dui)比度。

圖(tu)(tu)(tu)(tu)1：彈性散射(she)光(guang)(guang)片顯(xian)微鏡(jing)(jing)中偏振(zhen)(zhen)和相干控制的(de)(de)實驗裝置示(shi)意圖(tu)(tu)(tu)(tu)。圖(tu)(tu)(tu)(tu)（a）：光(guang)(guang)片照明(ming)(ming)光(guang)(guang)路由一對(dui)發射(she)波(bo)長分別為(wei)(wei)515nm和638nm的(de)(de)二(er)極(ji)管(guan)激光(guang)(guang)器和一個(ge)超(chao)連續譜激光(guang)(guang)器（SCL）組成(cheng)。激光(guang)(guang)束在(zai)(zai)進入顯(xian)微鏡(jing)(jing)之前(qian)被放(fang)大10倍。P1是一個(ge)半(ban)波(bo)片（HWP），它在(zai)(zai)通過柱面透鏡(jing)(jing)（CL）、振(zhen)(zhen)鏡(jing)(jing)（GM）和照明(ming)(ming)物(wu)鏡(jing)(jing)（OBJill）之前(qian)控制三(san)束光(guang)(guang)束的(de)(de)偏振(zhen)(zhen)。GM掃描OBJill瞳孔(kong)處(chu)的(de)(de)光(guang)(guang)束，在(zai)(zai)樣(yang)品平面上產生(sheng)一個(ge)旋轉的(de)(de)光(guang)(guang)片。樣(yang)品保存(cun)在(zai)(zai)裝滿水的(de)(de)定制浸(jin)沒室(shi)（C）中。檢測系(xi)統由一個(ge)0.5N.A.物(wu)鏡(jing)(jing)（OBJdet）、一個(ge)200mm管(guan)透鏡(jing)(jing)（總放(fang)大倍率為(wei)(wei)20X）和一個(ge)偏振(zhen)(zhen)器（P2）組成(cheng)。圖(tu)(tu)(tu)(tu)（b）：FYLA激光(guang)(guang)器在(zai)(zai)500-700nm（140nmFWHM）波(bo)段的(de)(de)發射(she)光(guang)(guang)譜，紅色垂(chui)直波(bo)段為(wei)(wei)紅色二(er)極(ji)管(guan)激光(guang)(guang)器的(de)(de)帶寬（1.2nm）。圖(tu)(tu)(tu)(tu)（c）：靠近(jin)照明(ming)(ming)物(wu)鏡(jing)(jing)（OBJill）的(de)(de)光(guang)(guang)學設置的(de)(de)細(xi)節，說(shuo)明(ming)(ming)了旋轉光(guang)(guang)片方(fang)法。FYLA激光(guang)(guang)片圍繞位于OBJill工(gong)作距離（WD）的(de)(de)軸(zhou)旋轉，即(ji)位于樣(yang)品平面的(de)(de)中心(xin)

FYLA超連(lian)續譜(pu)激光是否(fou)在LSFM中實現(xian)了無標記的(de)結(jie)構成像?

以(yi)上(shang)實(shi)驗結果表明(ming)，與其他光譜(pu)帶(dai)寬較窄(zhai)的光源(yuan)相比(bi)(bi)，Iceblink超連續譜(pu)光源(yuan)對(dui)LSM圖(tu)像(xiang)(xiang)的散斑貢獻較低，從(cong)而可以(yi)總結出彈性(xing)散射(she)光片顯微鏡(jing)是一種適用于(yu)無標記結構成像(xiang)(xiang)的新型光片成像(xiang)(xiang)方(fang)式。為了提高此配置中(zhong)的成像(xiang)(xiang)質量，他們還建議實(shi)施：1、偏振(zhen)控制(zhi)，可實(shi)現對(dui)比(bi)(bi)度選擇性(xing)并消除基板背景。2、時間和空間相干性(xing)降低，可以(yi)從(cong)散斑噪聲中(zhong)提取內(nei)源(yuan)性(xing)內(nei)在對(dui)比(bi)(bi)度。

以(yi)這種(zhong)(zhong)方式(shi)實(shi)施，彈性散(san)射光片(pian)(pian)成像為標準(zhun)LSFM實(shi)驗提供了有(you)(you)用(yong)的(de)(de)(de)補充結構信(xin)息(xi)，如(ru)(ru)MCTS樣(yang)品(pin)所(suo)示。此外，它有(you)(you)可(ke)能類似于組織切片(pian)(pian)但以(yi)非破壞(huai)性方式(shi)提供樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)相關形態學(xue)細節(jie)。最 后，彈性散(san)射光片(pian)(pian)顯微鏡是一種(zhong)(zhong)很有(you)(you)前(qian)途的(de)(de)(de)技術，可(ke)以(yi)進(jin)行(xing)新的(de)(de)(de)有(you)(you)趣的(de)(de)(de)實(shi)驗，例如(ru)(ru)，在受低信(xin)噪比(bi)限制的(de)(de)(de)應用(yong)中替代(dai)LSFM，例如(ru)(ru)功能成像或快速體積結構成像。

圖2：使用彈性散射光(guang)片顯微鏡(jing)系(xi)統(tong)獲(huo)得的(de)線蟲頭部(bu)圖像(xiang)。a）使用FYLA光(guang)源(yuan)(yuan)的(de)蠕蟲頭部(bu)3D圖像(xiang)堆棧(zhan)的(de)最 大強度投影（圖像(xiang)尺寸為230×110μm）。b）是(shi)使用FYLA Iceblink光(guang)源(yuan)(yuan)獲(huo)得的(de)（a）平面之一(yi)的(de)細節(jie)（圖像(xiang)為80×40μm）。c）是(shi)使用488nmCW二極管激光器獲(huo)得的與（b）相同的圖像(xiang)（圖像(xiang)為(wei)80×40μm）

來源文獻：

Enhanced Light Sheet Elastic Scattering Microscopy by Using a Supercontinuum Laser.

Diego Di Battista, David Merino, Giannis Zacharakis, Pablo Loza-Alvarez and Omar E. Olarte.

關于超連續激光器

超連(lian)續譜激光(guang)(guang)(guang)(guang)器（Supercontinuum Sources）又稱白(bai)光(guang)(guang)(guang)(guang)激光(guang)(guang)(guang)(guang)器。2000年(nian)，RANKA等報道了(le)在光(guang)(guang)(guang)(guang)子晶(jing)(jing)體光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)(xian)中產(chan)生(sheng)2倍頻(pin)程的(de)(de)(de)超連(lian)續譜，超連(lian)續譜的(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)為非線(xian)性(xing)(xing)光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)(xian)光(guang)(guang)(guang)(guang)學領(ling)域(yu)的(de)(de)(de)研究注入了(le)新的(de)(de)(de)活(huo)力(li)。利用光(guang)(guang)(guang)(guang)子晶(jing)(jing)體光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)(xian)產(chan)生(sheng)超連(lian)續譜是一種新型的(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)源(yuan)，它具有高(gao)的(de)(de)(de)輸出(chu)功(gong)率、平坦的(de)(de)(de)寬帶(dai)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜、高(gao)度的(de)(de)(de)空間相干性(xing)(xing)（聚焦）等特性(xing)(xing)，能極大提高(gao)信噪比、減小測量時問以及加寬光(guang)(guang)(guang)(guang)譜測量范圍。光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)(xian)超連(lian)續譜光(guang)(guang)(guang)(guang)源(yuan)可應(ying)用在光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)(xian)衰減測量、干涉測量儀、光(guang)(guang)(guang)(guang)相十攝影術、光(guang)(guang)(guang)(guang)譜學分析(xi)、生(sheng)物成像、光(guang)(guang)(guang)(guang)學頻(pin)率梳等領(ling)域(yu)。

關(guan)于Iceblink超連續激光(guang)器(qi)

Iceblink是一款(kuan)覆蓋450- 2300nm光(guang)(guang)(guang)譜范(fan)圍的(de)(de)超連續光(guang)(guang)(guang)纖(xian)激(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器，具有超過1W的(de)(de)平均功(gong)率和(he)(he)(he)zhuo 越的(de)(de)穩定性(0.5%標準偏差)。它是一種用途廣泛的(de)(de)白光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)源，在科學(xue)和(he)(he)(he)工業領域有著廣泛的(de)(de)應(ying)用，典型應(ying)用包括材料表征、VIS、NIR和(he)(he)(he)IR光(guang)(guang)(guang)譜、單分子光(guang)(guang)(guang)譜和(he)(he)(he)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)激(ji)(ji)發的(de)(de)吸收/透射測量(liang)。 Iceblink的(de)(de)空間(jian)相干(gan)性和(he)(he)(he)寬(kuan)光(guang)(guang)(guang)譜范(fan)圍使其成為傳統燈(deng)源、單波(bo)長(chang)激(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器、LED和(he)(he)(he)ASE光(guang)(guang)(guang)源的(de)(de)jue 佳替代品。

圖3：Iceblink超(chao)連續激光器實(shi)物圖

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