純相位空間光調制器在PSF工程中的應用
一、引言
2014年諾貝爾化學(xue)獎揭(jie)曉，美國及德國三(san)位科學(xue)家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎。獲獎理由是(shi)“研(yan)制出超分(fen)辨(bian)率熒光顯微鏡(jing)”，從(cong)此(ci)人們對點擴散(san)函數 (PSF) 工程的認識有了顯著(zhu)提高。
Moerner 展(zhan)示了 PSF 工(gong)程(cheng)與 Meadowlark Optics SLM 的(de)使用(yong)案例(li)，用(yong)于熒光發射器(qi)的(de)超分辨率成(cheng)像和 3D 定位。 PSF工(gong)程(cheng)已被證明(ming)使顯(xian)微(wei)鏡能夠(gou)使用(yong)多種成(cheng)像模式(shi)對(dui)樣本進(jin)行成(cheng)像，同(tong)時以非機械(xie)方(fang)(fang)式(shi)在模式(shi)之間變化。這允許對(dui)具有弱折射率的(de)結構進(jin)行成(cheng)像，以及對(dui)相(xiang)(xiang)位結構進(jin)行定量(liang)測(ce)量(liang)。 已證明(ming)的(de)成(cheng)像方(fang)(fang)式(shi)包括(kuo)：螺旋相(xiang)(xiang)位成(cheng)像、暗場成(cheng)像、相(xiang)(xiang)位對(dui)比成(cheng)像、微(wei)分干(gan)涉(she)對(dui)比成(cheng)像和擴展(zhan)景深成(cheng)像。
美國Meadowlark Optics 公(gong)司專注于(yu)模(mo)擬尋址純(chun)相位空間(jian)光(guang)(guang)調制器(qi)的設 計、開(kai)發和制造(zao)，有40多年的歷(li)史，該公(gong)司空間(jian)光(guang)(guang)調制器(qi)產品廣泛應用(yong)于(yu)自適應光(guang)(guang)學(xue)，散射或渾濁介質中的成(cheng)(cheng)像，雙(shuang)光(guang)(guang)子/三光(guang)(guang)子顯(xian)微成(cheng)(cheng)像，光(guang)(guang)遺傳學(xue)，全息光(guang)(guang)鑷(HOT)，脈沖整形，光(guang)(guang)學(xue)加(jia)密，量子計算(suan)，光(guang)(guang)通(tong)信，湍流模(mo)擬等領域。其高(gao)分(fen)辨(bian)率、高(gao)刷新率、高(gao)填充因子的特點適用(yong)于(yu)PSF工程(cheng)應用(yong)中。
圖1. Meadowlark 2022年(nian)推出 1024 x 1024 1K刷新率SLM
二、空間光調制器在PSF工程中的技術介紹
在(zai)單分(fen)子(zi)定位顯(xian)微(wei)鏡(jing)（SMLM）中，通(tong)過(guo)從(cong)相(xiang)機視場中稀疏分(fen)布的(de)發射點來估計單個分(fen)子(zi)的(de)位置，從(cong)而(er)克服了分(fen)辨(bian)率(lv)的(de)衍(yan)射限(xian)制(zhi)(zhi)。可實現的(de)分(fen)辨(bian)率(lv)受到定位精度和(he)熒光(guang)標(biao)簽密度的(de)限(xian)制(zhi)(zhi)，在(zai)實踐(jian)中可能(neng)是幾十納米的(de)數量級。有科研團隊(dui)已經將這種技術擴展(zhan)到三維定位。通(tong)過(guo)在(zai)光(guang)路中加入一個圓(yuan)柱形透鏡(jing)或使用雙平面或多焦點成像，可以估算出分(fen)子(zi)的(de)軸向位置。光(guang)斑的(de)拉長（散光(guang)）或光(guang)斑大(da)小的(de)差異（雙平面成像）對軸向位置進行(xing)編碼。將空間光(guang)調制(zhi)(zhi)器(qi)（SLM）與(yu)4F中繼系統結(jie)合到成像光(guang)路中，可以設計更廣泛的(de)點擴散函(han)數（PSF），為優化(hua)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)定位性能(neng)提(ti)供(gong)了可能(neng)。
利(li)用空(kong)間(jian)光調制(zhi)器（SLM）對(dui)熒光顯微(wei)鏡進行校準，可以建(jian)立一個遠低(di)于(yu)衍射(she)極限的(de)波(bo)前誤差，SIEMONS團隊就利(li)用Meadowlark空(kong)間(jian)光調制(zhi)器實(shi)現了高精度(du)的(de)波(bo)前控制(zhi)。原理證明和(he)實(shi)驗(yan)顯示，在(zai)(zai)(zai)1微(wei)米(mi)(mi)(mi)的(de)軸(zhou)向范圍內，在(zai)(zai)(zai)x、y和(he)λ的(de)精度(du)低(di)于(yu)10納(na)米(mi)(mi)(mi)，在(zai)(zai)(zai)z的(de)精度(du)低(di)于(yu)20納(na)米(mi)(mi)(mi)。對(dui)這篇文獻(xian)感興趣的(de)話可以聯系我們查閱文獻(xian)原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》
下面我們來具體看看是如何應用(yong)的，以及應用(yong)效果(guo)如何。
圖2. A）SLM校準分支和通過光路的偏振傳輸示意圖。額外的線性偏振濾波器沒有被畫出來，因為它們與偏振分光器對齊。B）相機上的強度響應作為λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數。C) 光學裝置的示意圖。一個帶有SLM的中繼系統被添加到顯微鏡的發射路徑中（紅色），一個單獨的SLM校準路徑（綠色）被納入發射中繼系統中。這允許在實驗之間進行SLM校準。BE：擴束器，DM：分色鏡，L：鏡頭，LPF：線性偏振濾鏡，M：鏡子。OL：物鏡，PBS：偏振分光鏡，TL：管鏡。
光(guang)(guang)路如上圖(tu)2所示(shi)，包括(kuo)一臺尼康Ti-E顯微鏡，帶有TIRF APO物鏡（NA = 1.49，M = 100），一個(ge)(ge)200毫米(mi)的(de)管狀鏡頭，一個(ge)(ge)帶有SLM的(de)中繼系統被建立在(zai)顯微鏡的(de)一個(ge)(ge)出口端(duan)口。中繼系統包括(kuo)兩個(ge)(ge)消色差透鏡，一個(ge)(ge)向列(lie)型液晶空間光(guang)(guang)調制器(qi)（LCOS）SLM（Meadowlark，XY系列(lie)，512x512像素，像素大小=15微米(mi)，設計波長=532納米(mi)）和(he)一個(ge)(ge)偏(pian)振分光(guang)(guang)器(qi)，用于過(guo)濾未被SLM調制的(de)X偏(pian)振光(guang)(guang)。di一個(ge)(ge)消色差透鏡在(zai)SLM上轉發光(guang)(guang)束(shu)。
第二個中繼鏡頭確保在EMCCD上對熒光物體進行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長為405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。
這(zhe)(zhe)個(ge)配置(zhi)增加(jia)了(le)(le)一個(ge)用于(yu)校準SLM的(de)(de)(de)第(di)二(er)個(ge)光(guang)(guang)路。這(zhe)(zhe)個(ge)空降光(guang)(guang)調(diao)制器(qi)校準光(guang)(guang)路是(shi)為測量入射(she)到(dao)(dao)SLM上(shang)的(de)(de)(de)X和Y偏(pian)振光(guang)(guang)之(zhi)間的(de)(de)(de)延遲差(cha)(cha)而設(she)計的(de)(de)(de)，為了(le)(le)測量某(mou)個(ge)SLM像素的(de)(de)(de)調(diao)制，需(xu)要將SLM映射(she)到(dao)(dao)校準路徑的(de)(de)(de)相機上(shang)。這(zhe)(zhe)種映射(she)是(shi)通過在(zai)SLM上(shang)施(shi)加(jia)一個(ge)電壓(ya)增加(jia)的(de)(de)(de)棋盤圖(tu)案來(lai)獲(huo)得的(de)(de)(de)。平均捕獲(huo)的(de)(de)(de)圖(tu)像和沒(mei)有施(shi)加(jia)電壓(ya)時的(de)(de)(de)圖(tu)像之(zhi)間的(de)(de)(de)差(cha)(cha)異被(bei)用作角落(luo)檢(jian)測算(suan)法（來(lai)自Matlab - Mathworks的(de)(de)(de)findcheckerboard）的(de)(de)(de)輸入，以找到(dao)(dao)角落(luo)點。對這(zhe)(zhe)些點進行仿生變換，并用于(yu)找到(dao)(dao)對應于(yu)每個(ge)SLM像素的(de)(de)(de)CMOS像素。
圖3. SLM校準(zhun)程序。A) 單(dan)個SLM像(xiang)(xiang)素(su)的(de)(de)測(ce)量強度(du)響應(ying)(ying)作(zuo)(zuo)為(wei)應(ying)(ying)用電(dian)壓的(de)(de)函(han)數(shu)。每一(yi)個極值(zhi)(zhi)都對應(ying)(ying)于(yu)等于(yu)π的(de)(de)整數(shu)倍(bei)的(de)(de)相位(wei)(wei)變化，并(bing)擬合(he)一(yi)個二階多(duo)項(xiang)式以(yi)提高尋(xun)找極值(zhi)(zhi)的(de)(de)精度(du)。強度(du)被分割成四個部(bu)(bu)分，它們被縮放為(wei)[0 1]。這(zhe)個歸(gui)一(yi)化的(de)(de)強度(du)（B）被轉(zhuan)換為(wei)相位(wei)(wei)（C），并(bing)反轉(zhuan)以(yi)創建該特定(ding)電(dian)壓段和像(xiang)(xiang)素(su)的(de)(de)LUT（D）。E）20個隨機選擇的(de)(de)SLM像(xiang)(xiang)素(su)的(de)(de)歸(gui)一(yi)化強度(du)響應(ying)(ying)，顯示像(xiang)(xiang)素(su)間(jian)的(de)(de)變化。F) 測(ce)量的(de)(de)波前均(jun)方根誤差是校準(zhun)后立即使用校準(zhun)LUT的(de)(de)相位(wei)(wei)的(de)(de)函(han)數(shu)，45分鐘后，以(yi)及制造(zao)商提供的(de)(de)LUT。G) 在不同的(de)(de)恒定(ding)相位(wei)(wei)下，用于(yu)成像(xiang)(xiang)光路的(de)(de)SLM部(bu)(bu)分的(de)(de)LUTs。暗點表(biao)示沒有3個蕞大值(zhi)(zhi)的(de)(de)像(xiang)(xiang)素(su)。H) 測(ce)量的(de)(de)平均(jun)相位(wei)(wei)和預定(ding)相位(wei)(wei)之間(jian)的(de)(de)差異作(zuo)(zuo)為(wei)預定(ding)相位(wei)(wei)的(de)(de)函(han)數(shu)。
圖3解釋了(le)(le)(le)SLM像(xiang)素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)校準程序(xu)。首先，以(yi)256步測量作(zuo)為(wei)應(ying)(ying)用電(dian)(dian)壓(ya)函數的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)強度響應(ying)(ying)，產(chan)生一連串的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最小值(zhi)和(he)蕞(zui)大值(zhi)，它們對(dui)應(ying)(ying)于π或2π的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)遲滯。在被(bei)(bei)照亮的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)SLM平面內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)所有像(xiang)素(su)(su)(su)似乎有三(san)個蕞(zui)大值(zhi)，這意味(wei)著(zhu)總的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)位調制(zhi)為(wei)4π或1094納米。這些極(ji)值(zhi)出(chu)現的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)電(dian)(dian)壓(ya)是(shi)通(tong)過對(dui)極(ji)值(zhi)附近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)三(san)個點進行擬(ni)合(he)拋物線來(lai)找(zhao)到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，這增加了(le)(le)(le)精(jing)度，并充分(fen)(fen)(fen)利用了(le)(le)(le)SLM的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)16位控制(zhi)。然后，強度被(bei)(bei)分(fen)(fen)(fen)為(wei)四段，用公式(shi)（11）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)逆值(zhi)對(dui)這些段進行縮放并轉換為(wei)相(xiang)位。相(xiang)位響應(ying)(ying)被(bei)(bei)用來(lai)為(wei)每(mei)個SLM像(xiang)素(su)(su)(su)構(gou)建一個單獨的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)查找(zhao)表(biao)（LUT），以(yi)補償SLM的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)均勻(yun)性(xing)。LUT參數在SLM上平滑變化(hua)(hua)，并與(yu)(yu)肉眼(yan)可(ke)(ke)見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)法布(bu)里-珀羅(luo)條(tiao)紋大致(zhi)對(dui)應(ying)(ying)，表(biao)明(ming)相(xiang)位響應(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異是(shi)由(you)于液晶層(ceng)厚度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)造(zao)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。額外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)像(xiang)素(su)(su)(su)與(yu)(yu)像(xiang)素(su)(su)(su)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)可(ke)(ke)能來(lai)自底(di)層(ceng)硅開(kai)關電(dian)(dian)路(lu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)像(xiang)素(su)(su)(su)與(yu)(yu)像(xiang)素(su)(su)(su)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)。完整(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)校準需要大約5分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)（在四核3.3GHz i7處(chu)理器上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)掃描和(he)2分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)計算時(shi)間），但(dan)原則上可(ke)(ke)以(yi)優化(hua)(hua)到(dao)運行更快。
實驗結果：
圖4 測量的PSF與矢(shi)量PSF模型擬合之間(jian)的PSF比較。G-I）平均測量的PSF是(shi)由大約108個(ge)光子攜帶的信號通(tong)過(guo)上采樣（3×）和覆蓋所有獲(huo)得的斑點(dian)編制(zhi)而成。比例尺表(biao)示1μm。
圖4顯示PSF模型的預測結果。通過這種方式，實驗的PSF是由∼108個光子的累積信號建立起來的。實驗和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的，甚至在蕞大的離焦值的邊緣結構也是非常匹配的。剩下的差異，主要是光斑的輕微變寬，是由于入射到相機上的光的非零光譜寬度，由于發射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區域的寬度。邊緣結構中也有一個小的不對稱性，這可能是由光學系統中殘留的高階球差造成的。
所有工(gong)(gong)程(cheng)PSF的(de)(de)一個共(gong)同特點(dian)是(shi)，與簡單(dan)的(de)(de)二維(wei)聚焦斑(ban)點(dian)相比(bi)，它們的(de)(de)復雜(za)性必須在PSF模型(xing)(xing)(xing)中得(de)到體現，該模型(xing)(xing)(xing)被(bei)用(yong)于估計(ji)三維(wei)位(wei)置（可(ke)能還(huan)有發射顏色或分(fen)子方向）的(de)(de)參(can)數擬(ni)(ni)合(he)算法。簡化的(de)(de)PSF模型(xing)(xing)(xing)，如高(gao)斯模型(xing)(xing)(xing)、基于標量(liang)衍射的(de)(de)Airy模型(xing)(xing)(xing)、Gibson-Lanni模型(xing)(xing)(xing)，或基于Hermite函(han)數的(de)(de)有效模型(xing)(xing)(xing)都(dou)不能滿足(zu)這一要(yao)求。一個解決(jue)方案(an)是(shi)使用(yong)實(shi)驗參(can)考(kao)PSF，或用(yong)花(hua)樣擬(ni)(ni)合(he)這樣的(de)(de)PSF作為(wei)模型(xing)(xing)(xing)PSF，或者使用(yong)一個或多(duo)個查(cha)找表（LUTs）來估計(ji)Z-位(wei)置。矢量(liang)PSF模型(xing)(xing)(xing)也可(ke)以用(yong)于復雜(za)的(de)(de)3D和(he)3D+λ工(gong)(gong)程(cheng)PSF。矢量PSF模型是高NA熒光成像系統中圖像形成的物理正確模型。復雜的工程PSF的另一個共同特點是對擾亂設計的PSF形狀的像差的敏感性，并以這種方式對精度和準確性產生負面影響。為了實現jing確到Cramér-Rao下限（CRLB），即無偏估計器的蕞佳精度，光學系統的像差水平應該被控制在衍射極限（0.072λ均方根波前像差），這個條件在實踐中往往無法滿足。因此，需要使用可變形鏡或為產生工程PSF而存在的SLM對像差進行校正。自適應光學元件的控制參數可以使用基于圖像的指標或通過測量待校正的像差來設置。后者可以通過基于引入相位多樣性的相位檢索算法來完成，通常采用通焦珠掃描的形式。這已經在高數值孔徑顯微鏡系統、定位顯微鏡中實現，并用于提高STED激光聚焦的質量。
三、PSF應(ying)用(yong)對液晶(jing)空(kong)間(jian)光調制器的要求
1.光利用率
對于這個應用(yong)來(lai)說，SLM將光學損(sun)失(shi)降(jiang)到蕞低是很重要的(de)(de)。PSF工程使用(yong)SLM來(lai)操縱顯微(wei)鏡發(fa)射路徑上的(de)(de)波前。在不增(zeng)加損(sun)失(shi)的(de)(de)情況下，熒光成像中缺(que)乏信號。使用(yong)具有高填充系數的(de)(de)SLM可以蕞大限(xian)度(du)地減少衍射的(de)(de)損(sun)失(shi)。
Meadowlark公司能提供標速版95.6%的空間光調制器，分辨率達1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到*，一級衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿足創建復雜相位函數的同時，能夠提升系統的光利用率。
2.刷新(xin)率（蕞高可(ke)達1K Hz）
高速度可以實現實時的深層組織超分辨率成像。可見光波段蕞高可達1K Hz刷新速度（@532nm）。
3.分辨率（1920x1200）
高(gao)分辨率的SLM是創建三維定(ding)位所需的復雜相位函數的理想選(xuan)擇(ze)，如此能夠對每個小像元(yuan)區域的光(guang)場進行自由(you)調控。
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