超分辨高(gao)精度(du)顯(xian)微鏡3D成像模塊

光學(xue)(xue)顯微鏡憑借(jie)其非(fei)接觸(chu)、無損傷(shang)等(deng)優點，成為(wei)生(sheng)物學(xue)(xue)家研究細胞(bao)功能結構、蛋白網絡結構、DNA等(deng)遺傳物質、細胞(bao)器以及膜結構等(deng)應用不可少的工具(ju)，然而衍射極限的存在(zai)，使得(de)人們無法清晰地觀(guan)察到橫向尺(chi)寸小于(yu)200nm、軸向尺(chi)寸小于(yu)500nm的細胞結構。二十一世紀初期(qi)，具(ju)有納米尺(chi)度分辨率的超分辨光學顯微(wei)成(cheng)像技術的出(chu)現(xian)，使得(de)研究(jiu)人員可以(yi)在(zai)更高(gao)的分辨率水平進行生物研究(jiu)。在(zai)超分辨顯微技(ji)術(shu)飛速發展(zhan)的(de)同時(shi)，現有成(cheng)像技(ji)術(shu)的(de)缺陷也日益顯現，例如成(cheng)像分辨率和成(cheng)像時(shi)間不(bu)可(ke)兼得；對透鏡(jing)制造技(ji)術(shu)提出了一定要求的(de)同時(shi)，也限制了觀測的(de)視野；日益復雜的(de)設備使(shi)得操作和維護也越來越困難等。

為解決上述(shu)問題,美國Double Helix Optics公司提出(chu)了納米級分(fen)辨率成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)的(de)新概念-“SPINDLE"，不僅突破(po)了衍射極限，還可以實現三維成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)，可捕捉到小至橫向(xiang)尺(chi)寸10 nm、軸向(xiang)尺(chi)寸15 nm的(de)細(xi)節。在該(gai)技(ji)術中(zhong)，SPINDLE模塊被安裝在顯微鏡和(he)(he)ccd或(huo)相機(ji)之間，無需(xu)改變現有成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)系統(tong)設置。基于特殊設計(ji)(ji)的(de)相位(wei)掩(yan)模版，從(cong)工(gong)程化點擴散(san)函(han)數(shu) (E-PSF)出(chu)發，使(shi)用(yong)螺旋相位(wei)掩(yan)模板(ban)來控制景深、發射波(bo)長和(he)(he)精(jing)(jing)度(du)，結合(he)3DTRAX軟件對3D圖(tu)像(xiang)(xiang)進行重建和(he)(he)分(fen)析(xi)，可在不需(xu)要掃描的(de)條件下即時捕獲 3D 信息(xi)，得到深度(du)和(he)(he)精(jing)(jing)度(du)3D圖(tu)像(xiang)(xiang)，橫向(xiang)精(jing)(jing)度(du)可達20nm, 軸向(xiang)精(jing)(jing)度(du)可達25nm，成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)深度(du)可達20um。當與其他工(gong)具和(he)(he)技(ji)術，包括STORM、PALM、SOFI、光片(pian)顯微、寬(kuan)場(chang)、寬(kuan)場(chang)顯微、TIRF、FRET等一起使(shi)用(yong)時，可釋放巨大的(de)潛力，適用(yong)于活細(xi)胞(bao)(bao)、固定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)全細(xi)胞(bao)(bao)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)、單分(fen)子(zi)、粒子(zi)跟蹤和(he)(he)粒子(zi)計(ji)(ji)數(shu)等應用(yong)。

圖1：SPINDLE2雙通道顯微鏡模塊，用于同時多色、多深度3D成像(xiang)

SPINDLE2可以(yi)被很容易(yi)地安裝(zhuang)到現有顯(xian)微鏡和CCD或相機之間，內置(zhi)旁路(lu)模(mo)式可輕松返回到非3D光路(lu)，是(shi)實現單發(fa)超分辨和3D寬(kuan)場成像的理想(xiang)解(jie)決方(fang)案。

圖(tu)2：非(fei)洲(zhou)綠(lv)猴腎(shen)細胞的(de)3D 圖(tu)像(xiang)，微管(guan)和(he)肌動(dong)蛋白分別標記，兩種顏(yan)色同時成像(xiang)

在(zai)SPINDLE模(mo)塊中，最(zui)核心(xin)的(de)是經過特殊(shu)設計的(de)相(xiang)(xiang)(xiang)位掩模(mo)板，其尺寸和(he)設計需(xu)和(he)光(guang)(guang)(guang)學系統和(he)成(cheng)像條件相(xiang)(xiang)(xiang)匹配。這些(xie)相(xiang)(xiang)(xiang)位掩模(mo)板將單一物(wu)(wu)體(ti)發出的(de)光(guang)(guang)(guang)分裂成(cheng)兩(liang)個獨立的(de)旋轉的(de)光(guang)(guang)(guang)瓣(ban)，類似于(yu)雙螺旋。兩(liang)瓣(ban)的(de)中點(dian)(dian)對應物(wu)(wu)體(ti)發光(guang)(guang)(guang)源的(de)橫向(xiang)位置(zhi)，兩(liang)瓣(ban)的(de)夾角對應發光(guang)(guang)(guang)源的(de)軸向(xiang)位置(zhi)。由于(yu)旋轉180°時光(guang)(guang)(guang)斑可(ke)以保持聚(ju)焦，因此(ci)可(ke)以高(gao)精度地獲取發光(guang)(guang)(guang)“點(dian)(dian)"的(de)深(shen)度信(xin)息。收集的(de)數據由許多這些(xie)在(zai)不同方向(xiang)上與物(wu)(wu)體(ti)橫向(xiang)和(he)軸向(xiang)位置(zhi)相(xiang)(xiang)(xiang)對應的(de)分離(li)良(liang)好的(de)點(dian)(dian)組成(cheng)。經過對這些(xie)詳細的(de)目標點(dian)(dian)數據集處理和(he)圖像重建創建，即可(ke)得(de)到超(chao)高(gao)分辨率原始物(wu)(wu)體(ti)清(qing)晰的(de)三維結構。

圖3：工程化相位(wei)掩模板通過每(mei)幀成像更大的體積來(lai)節(jie)省時間(jian)和存儲空間(jian)，并降(jiang)低感光度

豐富(fu)多(duo)(duo)樣的相位掩模(mo)板庫，包括(kuo)雙螺旋，單螺旋，EDOF，四足(zu)，和多(duo)(duo)色(se)設(she)計以提供最大的控制(zhi)和靈活(huo)性(xing)。用戶可依據深(shen)度范圍(wei)、波長和其(qi)他光(guang)學參(can)數選擇(ze)合適的相位掩模(mo)版以滿足(zu)最佳的深(shen)度-精度平衡。

3DTRAX® 軟件用(yong)于計算(suan)每個粒子的z位(wei)置，運行(xing)(xing)專有算(suan)法以自動(dong)進行(xing)(xing)3D定位(wei)，以?20 nm的深度和分辨率渲染高精(jing)度3D圖像，用(yong)于單(dan)分子定位(wei)和跟蹤。對漂移進行(xing)(xing)自動(dong)校正并生成直觀(guan)的繪圖，同時保(bao)持高數據質(zhi)量(liang)。

圖(tu)4：3DTRAX®是非常易(yi)于使(shi)用的斐濟插(cha)件(jian)

使用(yong)適用(yong)于(yu) Windows、MacOS 和 Linux 的庫集成到您的工作(zuo)流程或(huo) OEM 儀器中，以 ThunderSTORM 或(huo)雙螺(luo)旋文件(jian)格式保存(cun)圖(tu)像并導出文件(jian)以供進(jin)一步分析，專有的反卷(juan)積算法可以在不損(sun)失(shi)精(jing)度的情況下重建全細胞圖(tu)像。

圖(tu)5：從左到右(you)：非洲綠猴腎細(xi)(xi)胞(bao)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)骨架，小(xiao)鼠胚胎成纖維細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)微管，小(xiao)鼠胚胎成纖維細(xi)(xi)胞(bao)細(xi)(xi)胞(bao)核中(zhong)的(de)復制DNA的(de)3D超分辨圖(tu)像

超(chao)分辨顯微鏡3D成像模塊應(ying)用

超(chao)分辨顯微成(cheng)(cheng)像(xiang)和(he)3D粒(li)子跟蹤技(ji)術為(wei)生(sheng)(sheng)物學和(he)生(sheng)(sheng)物醫(yi)學研究(jiu)、藥物發(fa)現、材料(liao)科學研究(jiu)和(he)工(gong)業檢測打(da)開了(le)一個充滿可(ke)能性的新世(shi)界。雙(shuang)螺旋工(gong)程(cheng)技(ji)術具有高達傳統顯微鏡30倍的成(cheng)(cheng)像(xiang)深度(du)，其為(wei)超(chao)分辨成(cheng)(cheng)像(xiang)帶來(lai)精度(du)-深度(du)平衡。在(zai)3D粒(li)子追蹤應用(yong)中，雙(shuang)螺旋工(gong)程(cheng)帶來(lai)的擴展的深度(du)可(ke)以實現更長粒(li)子軌(gui)跡的捕獲。

在(zai)生(sheng)命科學領(ling)域，雙(shuang)螺旋光工程正(zheng)在(zai)從癌癥和(he)免(mian)(mian)疫(yi)學(xue)到傳染病(bing)和(he)神經(jing)科(ke)學(xue)的(de)(de)生命科(ke)學(xue)的(de)(de)突破。研究人(ren)員通(tong)過使用(yong)SPINDLE模(mo)塊發(fa)現了新(xin)的(de)(de)細(xi)胞(bao)結構(gou)和(he)亞細(xi)胞(bao)的(de)(de)相互作用(yong)。研究神經(jing)退(tui)行性疾病(bing)的(de)(de)科(ke)學(xue)家們能夠(gou)看(kan)到以前從未見過的(de)(de)壓(ya)力顆粒(li)核3D圖像。同樣，研究免(mian)(mian)疫(yi)學(xue)的(de)(de)研究人(ren)員已經(jing)能夠(gou)重建整個T細(xi)胞(bao)。

在藥物(wu)開發領域，研究(jiu)人員已經可(ke)以看到和跟蹤藥(yao)物(wu)化(hua)(hua)合(he)物(wu)的(de)真正工(gong)作原理(li)，而不是簡單(dan)地模擬新(xin)的(de)化(hua)(hua)合(he)物(wu)。雙螺(luo)(luo)旋(xuan)光工(gong)程實(shi)現(xian)了在成(cheng)像和單(dan)粒子(zi)跟蹤(SPT)領域的(de)新(xin)突破，隨著追蹤分子(zi)的(de)能力跨越更(geng)大的(de)景深（高達20um），雙螺(luo)(luo)旋(xuan)可(ke)以記錄比以往任何時候更(geng)長的(de)軌跡，使得識別先導(dao)化(hua)(hua)合(he)物(wu)和加快(kuai)藥(yao)物(wu)發現(xian)變得更(geng)加容易。

在材料科學(xue)領(ling)域，借(jie)助3D納(na)米成像(xiang)和粒子跟蹤技術(shu)，無(wu)論是(shi)金屬(shu)、半導體、陶瓷(ci)、聚合物還是(shi)納(na)米材料研究，雙螺旋技術(shu)都可以讓您看到(dao)材料的(de)結構、流動性(xing)等性(xing)能。精密(mi)成像(xiang)與深(shen)度(du)擴展相結合，讓你(ni)對粒子動力學有了(le)新的(de)認識。有了(le)更多的(de)數據(ju)，就(jiu)可以更好地預(yu)測材料在任何給定應用領域中的(de)性(xing)能。

在工業檢測領域，雙螺旋工(gong)程可實現(xian)納(na)(na)米尺度的(de)(de)三維檢(jian)查。現(xian)在你可以在從微芯片到(dao)像(xiang)素級(ji)的(de)(de)產(chan)品中發現(xian)微小的(de)(de)缺陷和其他功能缺陷。納(na)(na)米級(ji)精(jing)度的(de)(de)檢(jian)測，可以提(ti)高質(zhi)量控制，節省時(shi)間，降低成本，提(ti)高產(chan)量和跟蹤質(zhi)量。

引文：[1]金錄嘉, 何洋, 瞿璐茜,等. 新型超分辨顯微技術的最新研究進展[J]. 光電產品與資訊, 2018, 9(3).

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相(xiang)關文獻：

(1)Anastasiia Misiura, et. al., “Single-Molecule Dynamics Reflect IgG Conformational Changes Associated with Ion-Exchange Chromatography," Analytical Chem., 2021

(2)Laura Hoppe Alvarez, et. al., “Controlling microgel deformation via deposition method and surface functionalization of solid supports,"

Phys. Chem. Chem. Phys., 2021,23, 4927-4934

(3)Xilin Yang, et. al., “Deep-Learning-Based Virtual Refocusing of Images Using an Engineered Point-Spread Function," ACS Photonics, 8, 7, 2174–2182, June 2021

(4)Anish R. Roy, et. al., “Exploring cell surface-nanopillar interactions with 3D super-resolution microscopy," BioRxiv, June 2021S. Li, J. Wu, H. Li, D. Lin, B. Yu, and J. Qu, “Rapid 3D image scanning microscopy with multi-spot excitation and double-helix point spread function detection," Optics Express, vol. 26, no. 18, p. 23585, 2018.

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