雙光子顯微(wei)成像用(yong)飛秒激(ji)光器(qi)

雙光(guang)子激(ji)發熒光(guang)（TPEF）顯微鏡，也(ye)稱為雙光(guang)子顯微鏡，是對活體組織深層三維(wei)成像的方法。深度(du)成像是TPEF顯微(wei)(wei)鏡(jing)固有的(de)(de)優勢，它(ta)使用了更(geng)(geng)長的(de)(de)激(ji)發波長（通常是近紅外波段），因而(er)其帶(dai)來的(de)(de)散射(she)比傳統共聚焦顯微(wei)(wei)鏡(jing)中所(suo)使用的(de)(de)較短的(de)(de)可見波長更(geng)(geng)少。更(geng)(geng)長的(de)(de)波長同(tong)時也減少了來自散射(she)光的(de)(de)背景照明，并增加了在更(geng)(geng)高深度(du)處的(de)(de)對(dui)比度(du)。目前，用TPEF顯微(wei)(wei)鏡(jing)可以獲得(de)1mm深度(du)的(de)(de)體內大腦圖(tu)像。

在(zai)熒光(guang)(guang)顯微(wei)鏡中，當(dang)兩個獨立的(de)光(guang)(guang)子(zi)(zi)被(bei)一種介(jie)質(zhi)同(tong)時吸收(shou)時，就(jiu)(jiu)會(hui)發生雙光(guang)(guang)子(zi)(zi)激發。這需(xu)要兩個合(he)適(shi)能量(liang)的(de)光(guang)(guang)子(zi)(zi)在(zai)這樣的(de)介(jie)質(zhi)上時間和(he)(he)空間上同(tong)時重合(he)；通(tong)常(chang)來(lai)說(shuo)這不需(xu)要非(fei)常(chang)大的(de)激發光(guang)(guang)子(zi)(zi)通(tong)量(liang)，當(dang)然光(guang)(guang)子(zi)(zi)通(tong)量(liang)越大， 雙光(guang)(guang)子(zi)(zi)同(tong)時被(bei)吸收(shou)的(de)概率(lv)(lv)就(jiu)(jiu)越大。在(zai)TPEF顯微(wei)鏡中，更高的(de)光(guang)(guang)子(zi)(zi)通(tong)量(liang)會(hui)帶來(lai)更高的(de)效(xiao)率(lv)(lv)，從而帶來(lai)圖(tu)像質(zhi)量(liang)和(he)(he)分辨率(lv)(lv)的(de)提升。

在(zai)TPEF顯微鏡(jing)(jing)中，雙(shuang)光(guang)子(zi)激(ji)(ji)(ji)發(fa)所(suo)需的(de)(de)大(da)光(guang)子(zi)通(tong)量(liang)更多的(de)(de)是(shi)通(tong)過寬波段(duan)可(ke)調諧(xie)的(de)(de)鈦寶石飛秒(miao)激(ji)(ji)(ji)光(guang)器(qi)實(shi)現的(de)(de)，激(ji)(ji)(ji)光(guang)器(qi)典型規格(ge)脈(mo)寬為(wei)100fs，重復(fu)頻率約為(wei)80MHz，這可(ke)以給雙(shuang)光(guang)子(zi)顯微鏡(jing)(jing)帶來非常高(gao)的(de)(de)峰值功(gong)(gong)(gong)率和大(da)光(guang)子(zi)通(tong)量(liang)。然(ran)而，激(ji)(ji)(ji)光(guang)器(qi)較(jiao)高(gao)的(de)(de)平均功(gong)(gong)(gong)率（在(zai)1~4瓦范圍內）會(hui)由于激(ji)(ji)(ji)發(fa)波長的(de)(de)線性(xing)吸(xi)收引(yin)起的(de)(de)與介(jie)質的(de)(de)光(guang)熱(re)相互(hu)作用(yong)而造成熱(re)損傷。這種效(xiao)應(ying)(ying)在(zai)體(ti)內成像(xiang)中尤其重要(yao)，因為(wei)溫度超過40oC會(hui)導致(zhi)不可(ke)逆(ni)的(de)(de)損傷。因此，傳統的(de)(de)固態(tai)激(ji)(ji)(ji)光(guang)器(qi)所(suo)提(ti)供(gong)的(de)(de)平均功(gong)(gong)(gong)率必須被衰減(jian)才能實(shi)際應(ying)(ying)用(yong)于TPEF顯微鏡(jing)(jing)，峰值功(gong)(gong)(gong)率也(ye)會(hui)相應(ying)(ying)地降低(di)(di)。保持較(jiao)低(di)(di)的(de)(de)平均功(gong)(gong)(gong)率以避免熱(re)損傷，同時(shi)縮短脈(mo)沖持續時(shi)間是(shi)一種替代(dai)的(de)(de)提(ti)高(gao)峰值功(gong)(gong)(gong)率的(de)(de)方法(fa)。這減(jian)少了光(guang)子(zi)落(luo)在(zai)介(jie)質上的(de)(de)時(shi)間間隔，同時(shi)提(ti)高(gao)了介(jie)質被吸(xi)收的(de)(de)概率。

近日，西(xi)班牙FYLA公(gong)司利(li)用先進超(chao)連(lian)續譜全光(guang)纖(xian)激(ji)光(guang)器(qi)技術得到脈(mo)沖寬(kuan)度短(duan)至15fs的商(shang)業激(ji)光(guang)器(qi)，命名(ming)型號“SCH"。與傳統的100fs激(ji)光(guang)器(qi)相比，SCH的15fs脈(mo)沖寬(kuan)度可在相同平均功率(lv)水平下(xia)提供(gong)超(chao)過傳統飛秒(miao)激(ji)光(guang)器(qi)7倍的光(guang)子通量。

圖1：FCH 寬光譜光纖(xian)飛秒激光器，波長范圍950-115nm，脈(mo)沖寬度15fs, 峰值功(gong)率>200kW

圖2：藍色(se)(se)線：SCH 飛秒(miao)激光器光譜(pu)曲線；橙色(se)(se)線：1um波段(duan)百秒(miao)激光器光譜(pu)曲線；灰(hui)色(se)(se)線：紅色(se)(se)熒光蛋白DsRed吸收(shou)截面光譜(pu)

但是，巨幅提高每(mei)個(ge)時間和面積(ji)上可用光子數量對圖(tu)像的真正影響(xiang)是什么呢？

一、更高的激(ji)發效率，更高的圖像(xiang)亮(liang)度

理論上，在(zai)(zai)雙光(guang)(guang)子(zi)(zi)顯微鏡中(zhong)，圖像(xiang)的(de)亮(liang)度與激發效率直接相(xiang)關(guan)，而激發效率*依賴(lai)于光(guang)(guang)子(zi)(zi)通量和熒(ying)光(guang)(guang)團的(de)二階非線(xian)性激發截面(GM) 。作為(wei)一個例(li)子(zi)(zi)，我們可以嘗試計(ji)算(suan)熒(ying)光(guang)(guang)蛋白(bai)mRFP在(zai)(zai)15fs激光(guang)(guang)脈(mo)寬(kuan)(kuan)（如SCH飛秒激光(guang)(guang)器）和1050nm中(zhong)波長照射下(xia)的(de)激發效率。與100fs的(de)激光(guang)(guang)器相(xiang)比，15fs激光(guang)(guang)器具有更(geng)(geng)寬(kuan)(kuan)的(de)帶寬(kuan)(kuan)（達200nm），可以在(zai)(zai)900到1200nm之間(jian)激發mRFP，與100fs激光(guang)(guang)器的(de)11nm相(xiang)比，這是一個更(geng)(geng)寬(kuan)(kuan)的(de)光(guang)(guang)譜(pu)區域。

圖3：藍色(se)(se)曲線(xian)：以(yi)1050nm為中心的SCH 15fs全光(guang)(guang)纖飛秒光(guang)(guang)纖激(ji)光(guang)(guang)器的峰值功(gong)率； 橙色(se)(se)曲線(xian)：以(yi)1050nm為中心的100fs光(guang)(guang)纖飛秒激(ji)光(guang)(guang)器的峰值功(gong)率；黑(hei)色(se)(se)曲線(xian)：mRFP的二階非線(xian)性激(ji)勵截面(GM)

考(kao)慮到各(ge)波長(chang)的(de)峰值(zhi)功率(lv)和激(ji)(ji)發(fa)截面，可以(yi)計算出(chu)mRFP的(de)激(ji)(ji)發(fa)效率(lv)。結果(guo)表明，與傳統100fs激(ji)(ji)光器(qi)相比較，SCH飛秒激(ji)(ji)光器(qi)15fs的(de)脈沖寬度使得(de)激(ji)(ji)發(fa)效率(lv)提(ti)高了(le)50%。

圖4：藍色曲線：SCH 15fs全光(guang)(guang)(guang)纖飛秒光(guang)(guang)(guang)纖激光(guang)(guang)(guang)器的(de)峰值(zhi)功率； 橙色曲線：100fs光(guang)(guang)(guang)纖飛秒激光(guang)(guang)(guang)器的(de)峰值(zhi)功率；黑色曲線：mRFP的(de)二(er)階(jie)非(fei)線性激勵截面(mian)(GM)

圖5：小(xiao)鼠(shu)腸道切片的2P熒光顯微鏡(jing)圖像，用SYTOX Green標記(ji)細(xi)胞核（黃(huang)色(se)）和Alexa Fluor 568煥鈦標記(ji)肌動(dong)蛋白絲（藍色(se)）

二、多色同時激發(fa)

想象(xiang)一下(xia)，同時成像(xiang)多(duo)個波(bo)(bo)段范圍(wei)(wei)的(de)熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)，而不必考慮選擇最佳激(ji)(ji)(ji)(ji)發波(bo)(bo)長的(de)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器。在(zai)雙光(guang)(guang)(guang)子顯微鏡中，使用傳統的(de)100fs激(ji)(ji)(ji)(ji)發激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器，這通常是一個復(fu)雜的(de)，有時甚(shen)至是不可(ke)能(neng)完(wan)成的(de)任務。傅(fu)里葉變(bian)換極限的(de)100fs近(jin)紅外固體飛秒(miao)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器（例如鈦寶石飛秒(miao)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器、920nm光(guang)(guang)(guang)纖飛秒(miao)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器）的(de)光(guang)(guang)(guang)譜寬度通常在(zai)10~20nm范圍(wei)(wei)內，它們只能(neng)同時激(ji)(ji)(ji)(ji)發激(ji)(ji)(ji)(ji)發光(guang)(guang)(guang)譜在(zai)10~20nm光(guang)(guang)(guang)譜范圍(wei)(wei)內的(de)熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)。因此(ci)，若想用單(dan)臺(tai)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器去同時激(ji)(ji)(ji)(ji)發更(geng)多(duo)種類的(de)熒光(guang)(guang)(guang)團(tuan)就需要帶寬更(geng)寬，脈沖更(geng)短(duan)的(de)激(ji)(ji)(ji)(ji)光(guang)(guang)(guang)器。

SCH寬(kuan)光(guang)譜飛秒激(ji)光(guang)器在提供15fs脈(mo)沖寬(kuan)度的(de)同(tong)時以(yi)1050nm為(wei)(wei)中心波長提供200nm的(de)帶寬(kuan)，在這(zhe)個帶寬(kuan)范(fan)圍內 （橫跨(kua)900到1200nm）的(de)所有(you)綠色和(he)紅色的(de)熒(ying)光(guang)團都可(ke)以(yi)同(tong)時被(bei)這(zhe)種激(ji)光(guang)器激(ji)發。這(zhe)對于雙光(guang)子顯微鏡來說，同(tong)時對多個熒(ying)光(guang)團成像(xiang)成為(wei)(wei)一個可(ke)行的(de)，實用的(de)和(he)簡單的(de)替(ti)代。

圖(tu)5：常見熒光探(tan)針激發(fa)波長

圖(tu)6：小鼠腸道的(de)雙光(guang)子熒(ying)光(guang)顯微鏡圖(tu)像

用(yong)Sytox Green標記細胞核（洋紅色(se)），FITC濾波器；用(yong)Alexa Fluor 568 Phaloidin標記肌動蛋(dan)白絲（綠色(se)），TRITC過(guo)濾器。兩種(zhong)熒光標記物(wu)同時被(bei)SCH激光器激發，用(yong)尼康的熒光濾片組過(guo)濾熒光。

Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.

綜上所述(shu)，FYLA公司推出的(de)(de)新型、緊(jin)湊而強大的(de)(de)SCH全光(guang)纖(xian)飛(fei)秒(miao)激(ji)光(guang)器激(ji)光(guang)器，提供15fs的(de)(de)脈沖持續時(shi)間和高峰值功率（>200kW），為體內樣本的(de)(de)低光(guang)損傷激(ji)發提供了(le)強大的(de)(de)工具。結合(he)全光(guang)纖(xian)激(ji)光(guang)器的(de)(de)緊(jin)湊性和堅固性性，SCH飛(fei)秒(miao)激(ji)光(guang)器成為雙光(guang)子顯微鏡的(de)(de)特(te)殊激(ji)光(guang)選(xuan)擇(ze)。

現在，FYLA公(gong)(gong)司推出SCH飛秒激(ji)光(guang)器(qi)的免費(fei)測(ce)試(shi)服務(wu)，包(bao)括運(yun)輸和安裝，無需承諾(nuo)購(gou)買(mai)，此外(wai)對(dui)已(yi)購(gou)買(mai)的客戶提供全(quan)面免費(fei)2年(nian)質保優惠政策，如(ru)果(guo)您(nin)對(dui)SCH激(ji)光(guang)器(qi)感(gan)興趣并(bing)有(you)意(yi)測(ce)試(shi)使(shi)用(yong)，請聯系(xi)上海昊量光(guang)電設備有(you)限公(gong)(gong)司。

關于(yu)昊量光電：

上海昊(hao)量(liang)光(guang)電設備(bei)(bei)有限公(gong)司是(shi)目(mu)前國(guo)內(nei)光(guang)電產(chan)(chan)品(pin)專業代(dai)理商(shang)，也是(shi)近(jin)年來(lai)發(fa)展(zhan)迅速的光(guang)電產(chan)(chan)品(pin)代(dai)理企業。除了擁有一批專業技(ji)術銷(xiao)售工程(cheng)師(shi)之外，還(huan)有擁有一支強(qiang)大技(ji)術支持(chi)隊伍。我們的技(ji)術支持(chi)團隊可以(yi)為(wei)客(ke)戶提供完整的設備(bei)(bei)安裝，培訓，硬件(jian)(jian)開發(fa)，軟件(jian)(jian)開發(fa)，系統集成(cheng)等工作。秉承(cheng)誠(cheng)信、高效、創新、共(gong)贏的核心(xin)價(jia)值觀，昊(hao)量(liang)光(guang)電堅持(chi)以(yi)誠(cheng)信為(wei)基(ji)石(shi)，憑(ping)借高效的運營機制(zhi)和(he)勇于(yu)創新的探(tan)索精神為(wei)我們的客(ke)戶與(yu)與(yu)合作伙(huo)伴不斷創造(zao)價(jia)值，實現各方共(gong)贏！

您可以通過(guo)昊量光(guang)電(dian)的網站了解更多的產品信息。