聲光偏轉器（AODF）在高速(su)熒光成像中的關鍵作用：FIRE技術(shu)簡介

在上一篇文章中（聲光偏轉器（AODF）在高速細胞分選中的關鍵作用：ICS技術簡介），我們學(xue)習了(le)發(fa)表在Science上的(de)(de)“High-Speed fluorescence Image-Enab LED Cell Sorting"，其中通過(guo)AODF實現了(le)一種基于高速熒(ying)光成(cheng)像的(de)(de)細胞分選(xuan)技術。而這(zhe)份速度是(shi)由FIRE高速熒(ying)光成(cheng)像系統帶來的(de)(de)，即使用射(she)頻標記發(fa)射(she)的(de)(de)熒(ying)光成(cheng)像系統。zui初(chu)是(shi)由來自加州大學(xue)洛杉磯分校的(de)(de)Eric D. Diebold, Brandon W. Buckley等四位(wei)科學(xue)家于2013年(nian)發(fa)表于Nature Photonics的(de)(de)“Digitally synthesized beat frequency multiplexing for sub-millisecond fluorescence microscopy"這(zhe)篇論文中提及。

FIRE技(ji)術（fluorescence imaging using radiofrequency-tagged emission）是將(jiang)一(yi)種(zhong)射(she)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)通信(xin)(xin)的(de)(de)方(fang)法應用于高速(su)熒光顯微鏡，同(tong)時結(jie)合了(le)(le)PMT的(de)(de)靈(ling)敏(min)度和(he)速(su)度優勢(shi)，并(bing)(bing)(bing)利(li)用頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)域信(xin)(xin)號復用、射(she)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)譜數(shu)字(zi)合成以(yi)及數(shu)字(zi)鎖相(xiang)放大，實現了(le)(le)千赫(he)茲幀率的(de)(de)熒光成像(xiang)(xiang)(xiang)，解決了(le)(le)emccd或者scmos用于流式細胞(bao)術速(su)度不(bu)足(zu)的(de)(de)問題(ti)。而(er)FIRE的(de)(de)核心特征在于樣品(pin)上每個單獨(du)點(dian)均能夠(gou)以(yi)不(bu)同(tong)射(she)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)激發熒光。在兩束移頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)激光之(zhi)間干涉所(suo)產生的(de)(de)拍頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)處，數(shu)字(zi)合成的(de)(de)射(she)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)“標記"了(le)(le)熒光發射(she)的(de)(de)各(ge)個像(xiang)(xiang)(xiang)素(su)點(dian)。這和(he)無線(xian)通信(xin)(xin)系統中(zhong)的(de)(de)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)率多路復用類似，FIRE圖像(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)一(yi)行內(nei)的(de)(de)每個像(xiang)(xiang)(xiang)素(su)點(dian)都被分配了(le)(le)自己的(de)(de)射(she)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)。單元(yuan)光電探(tan)測(ce)器同(tong)時檢測(ce)多個像(xiang)(xiang)(xiang)素(su)的(de)(de)熒光，并(bing)(bing)(bing)從(cong)探(tan)測(ce)器輸(shu)出的(de)(de)頻(pin)(pin)(pin)(pin)(pin)率分量(liang)中(zhong)重新(xin)構建圖像(xiang)(xiang)(xiang)（運用數(shu)字(zi)域的(de)(de)并(bing)(bing)(bing)行鎖相(xiang)放大來分辨(bian)）。

樣品中每(mei)個點能(neng)以(yi)不同(tong)的(de)(de)射頻來激發熒光的(de)(de)秘訣在(zai)于(yu)其中的(de)(de)馬赫-曾(ceng)德(de)爾干涉儀（MZI），并使用(yong)聲光器(qi)件來(lai)執行拍頻激發(fa)多路復(fu)用(yong)。如上圖a所示，MZI一路的光(guang)通過聲光(guang)偏轉器（AODF）產(chan)生頻移（帶寬為100MHz），由射頻頻率梳驅(qu)動，相位(wei)經過設計以最小(xiao)化(hua)峰值-平均功率比。AODF產生(sheng)多個偏(pian)轉光(guang)（+1級衍(yan)射光），包含(han)一系列的偏(pian)轉角(jiao)度和頻率偏(pian)移。MZI干涉(she)儀第二路光通過聲光移頻器（AOFS），該(gai)移(yi)頻器由(you)單(dan)個(ge)射(she)頻頻率驅動，提供本振（LO）光束。使用柱面(mian)透鏡來匹配LO光(guang)束與射(she)頻梳光(guang)束的發(fa)散角。在(zai)MZI干(gan)涉儀輸出的位置，兩束光通過(guo)分束器合并聚(ju)焦到樣品的一條水(shui)平線上，將頻(pin)率偏移映射到空間。

熒(ying)光在(zai)由(you)干涉儀(yi)兩路的差頻所定義的各個拍(pai)頻下被激發。樣品(pin)中(zhong)的熒(ying)光發射由(you)共聚焦配(pei)置的PMT檢測，并且通過狹縫來排(pai)除平面外(wai)的熒光發射。共振掃描振鏡（RS）在橫向(xiang)上(shang)進行(xing)高速掃描，即(ji)可以二維成像。考慮(lv)到(dao)熒光團的有(you)限頻(pin)率響應(ying)，選(xuan)擇LO光束(shu)的頻(pin)(pin)移將拍頻(pin)(pin)激(ji)發頻(pin)(pin)譜外差(cha)到基(ji)帶，以最大限度利用調制帶寬(kuan)。這是必要的，因為AOD通(tong)(tong)常在升頻(pin)的次倍(bei)頻(pin)通(tong)(tong)帶上工作(zuo)，以避(bi)免諧波干擾(rao)。用于驅動AOD的(de)(de)射頻頻率梳的(de)(de)直(zhi)接(jie)數(shu)字合(he)成（DDS）定(ding)(ding)義了每個(ge)像(xiang)素的激發，而(er)這(zhe)是(shi)通(tong)過特定(ding)(ding)的射頻(pin)和相(xiang)位決定(ding)(ding)的，從(cong)而(er)導致射頻(pin)頻(pin)率梳與檢測(ce)信(xin)號之間的相(xiang)位相(xiang)干性。而(er)這(zhe)種(zhong)相(xiang)位相(xiang)干性可以(yi)(yi)使用相(xiang)敏數字鎖(suo)相(xiang)放大器的并(bing)行陣列(lie)使得圖像(xiang)多路分解(jie)，這(zhe)可以(yi)(yi)在Matlab中實(shi)現。FIRE的并行讀出將(jiang)導致最大像素速(su)率等(deng)于(yu)AODF的帶寬。

圖(tu)(tu)2顯(xian)示(shi)了(le)FIRE顯(xian)微鏡的(de)(de)(de)典型輸出。檢(jian)測到的(de)(de)(de)時域信號(圖(tu)(tu)2a)是(shi)來(lai)自一排(pai)像(xiang)素的(de)(de)(de)射(she)頻標記發射(she)的(de)(de)(de)傅里葉(xie)疊加(jia)。使用短時傅里葉(xie)變換(huan)計算(suan)的(de)(de)(de)時間分(fen)辨頻譜(圖(tu)(tu)2b)揭示(shi)了(le)樣(yang)本在水平行內(nei)位(wei)置(zhi)相關的(de)(de)(de)頻率成分(fen)。而樣(yang)本的(de)(de)(de)垂(chui)直(zhi)位(wei)置(zhi)是(shi)從(cong)2.2KHz共(gong)振掃描鏡的(de)(de)(de)參考輸出中恢復出來(lai)的(de)(de)(de)，zui終(zhong)形(xing)成了(le)二(er)維的(de)(de)(de)圖(tu)(tu)像(xiang)（圖(tu)(tu)2c）。

在這里AOD有三項指(zhi)標至關重要(yao)，可分(fen)辨點(dian)數(shu)（掃(sao)(sao)(sao)描(miao)角度(du)），功率平坦化，掃(sao)(sao)(sao)描(miao)速度(du)。AOD的(de)(de)(de)帶寬越(yue)大(da)，自然(ran)掃(sao)(sao)(sao)描(miao)的(de)(de)(de)角度(du)也(ye)(ye)越(yue)大(da)，可分(fen)辨的(de)(de)(de)點(dian)數(shu)也(ye)(ye)越(yue)多。掃(sao)(sao)(sao)描(miao)時間意味著不(bu)同(tong)(tong)頻(pin)率間切換的(de)(de)(de)時間，自然(ran)也(ye)(ye)和成(cheng)像的(de)(de)(de)速度(du)息(xi)息(xi)相關。而(er)功率平坦化是AOD晶體和驅動(dong)器共同(tong)(tong)優(you)化的(de)(de)(de)結果，為了(le)在掃(sao)(sao)(sao)描(miao)的(de)(de)(de)帶寬內獲(huo)得近似的(de)(de)(de)衍射效率，不(bu)會使得掃(sao)(sao)(sao)描(miao)獲(huo)得的(de)(de)(de)線性激光陣列中間亮兩邊暗，提(ti)供(gong)均勻的(de)(de)(de)激發(fa)光。

G&H聲光偏轉器（AOD）可以提(ti)(ti)(ti)供(gong)適用(yong)于不同波長(chang)的(de)型號，在不超過幾度的(de)范(fan)圍內，分辨出成(cheng)百上(shang)千個點，掃(sao)描(miao)時間可以快至幾微秒。G&H為(wei)AOD提(ti)(ti)(ti)供(gong)光束的(de)精確空間控制(zhi)，無論是執行(xing)1D或2D掃(sao)描(miao)還是執行(xing)固定(ding)角(jiao)度的(de)光束偏轉。我們(men)的(de)聲光偏轉器可在整個掃(sao)描(miao)角(jiao)度上(shang)提(ti)(ti)(ti)供(gong)高度均勻(yun)的(de)衍射效率(lv)，并為(wei)材料處理(li)和數字成(cheng)像等掃(sao)描(miao)應用(yong)提(ti)(ti)(ti)供(gong)一(yi)致的(de)功(gong)率(lv)通過量。

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