光(guang)束勻化(hua)在(zai)熒光(guang)成像平場照(zhao)明中的應用

熒光顯微鏡

熒(ying)光顯微鏡屬于光(guang)學(xue)顯微鏡(jing)家族，基于熒(ying)光(guang)的(de)物理(li)效應。利用了所謂的(de)熒(ying)光(guang)染料的(de)顏色特(te)性(xing)，它們被特(te)定波(bo)長的(de)光(guang)激發，并以不同的(de)波(bo)長再次反射吸收的(de)光(guang)。

熒光顯微鏡的應用

熒光(guang)(guang)顯微鏡可(ke)以(yi)進行形態學(xue)(xue)研(yan)究、納米范(fan)圍內的(de)測(ce)量(liang)(liang)(liang)值分析以(yi)及實(shi)時可(ke)見(jian)的(de)大多數不同文化(hua)的(de)過程。無論(lun)是在生物(wu)化(hua)學(xue)(xue)、生物(wu)物(wu)理學(xue)(xue)還(huan)是醫(yi)學(xue)(xue)領域：快速、詳細地檢測(ce)明亮(liang)、多彩的(de)熒光(guang)(guang)有(you)助于熒光(guang)(guang)顯微鏡的(de)測(ce)量(liang)(liang)(liang)過程，并(bing)為新發現奠定基礎。zui 佳(jia)測(ce)量(liang)(liang)(liang)結果和(he)zui 佳(jia)分辨(bian)率(lv)需(xu)要(yao)zui精確的(de)光(guang)(guang)學(xue)(xue)器件——無論(lun)是通(tong)過光(guang)(guang)束(shu)路徑的(de)優(you)化(hua)和(he)聚焦、精確安裝的(de)濾光(guang)(guang)片(pian)還(huan)是高質量(liang)(liang)(liang)的(de)鍍膜。

熒光顯微鏡的結構和功能原理

允(yun)許(xu)個別波(bo)長通過的(de)(de)特(te)殊濾光(guang)片(pian)可(ke)(ke)確保熒(ying)光(guang)顯微鏡下(xia)熒(ying)光(guang)的(de)(de)可(ke)(ke)視化。熒(ying)光(guang)顯微鏡的(de)(de)特(te)殊濾光(guang)片(pian)包括：

勵磁濾光器

發射過濾器

二向色分束器

單獨的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)激發(fa)濾(lv)光(guang)(guang)(guang)(guang)片允許(xu)相(xiang)應波長的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)通過(guo)，這(zhe)(zhe)是激發(fa)待檢(jian)樣品(pin)中(zhong)特定染(ran)料所(suo)必需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。二向色(se)(se)鏡將(jiang)刺激波長反射(she)到物(wu)鏡，物(wu)鏡將(jiang)光(guang)(guang)(guang)(guang)束集中(zhong)到標(biao)本(ben)(ben)上。從(cong)標(biao)本(ben)(ben)反 射(she)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)集中(zhong)在物(wu)鏡中(zhong)，在其激發(fa)態通常具有(you)比(bi)入(ru)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)更(geng)(geng)高(gao)(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)波長。通過(guo)二向色(se)(se)鏡，反射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)通過(guo)發(fa)射(she)濾(lv)光(guang)(guang)(guang)(guang)片并(bing)(bing)降低(di)到發(fa)射(she)波長。尚未在二向色(se)(se)鏡處停止的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)刺激光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)留物(wu)在發(fa)射(she)濾(lv)光(guang)(guang)(guang)(guang)片處被過(guo)濾(lv)掉(diao)。理想情況下，只有(you)發(fa)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)撞擊顯微鏡內置的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測器(qi)，并(bing)(bing)以(yi)(yi)相(xiang)應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顏(yan)色(se)(se)可(ke)見。zui 佳測量結果(guo)(guo)需要(yao)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)照(zhao)(zhao)明，尤其是當(dang)需要(yao)幾微米或幾毫米的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)視(shi)野(ye)時(shi)。在不(bu)(bu)(bu)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)照(zhao)(zhao)明的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下，例(li)如(ru)(ru)，可(ke)能(neng)發(fa)生(sheng)待檢(jian)查分(fen)(fen)子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)(bu)(bu)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)激活。結果(guo)(guo)：中(zhong)心(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子比(bi)入(ru)射(she)照(zhao)(zhao)明光(guang)(guang)(guang)(guang)束外圍的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子發(fa)出更(geng)(geng)強烈(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒光(guang)(guang)(guang)(guang)。如(ru)(ru)果(guo)(guo)周邊(bian)沒有(you)與(yu)中(zhong)心(xin)等同地照(zhao)(zhao)亮，則當(dang)單獨記錄的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)圖像網格稍后合(he)并(bing)(bing)時(shi)，陰影(ying)繼續(xu)出現(xian)。因此，細胞和組織樣本(ben)(ben)等測量不(bu)(bu)(bu)能(neng)用(yong)于可(ke)靠的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)。這(zhe)(zhe)些問(wen)題可(ke)以(yi)(yi)通過(guo)使(shi)用(yong) a|TopShape a|BeamExpander 來解決。通過(guo)使(shi)用(yong)非球面(mian)可(ke)以(yi)(yi)實現(xian)這(zhe)(zhe)些元素在系統中(zhong)。我們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)系統以(yi)(yi)其緊湊的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)設計(ji)、精度和zui高(gao)(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)學質量而令(ling)人信服。使(shi)用(yong)光(guang)(guang)(guang)(guang)學組件a|TopShape 和 a|BeamExpander 可(ke)以(yi)(yi)將(jiang)高(gao)(gao)(gao)斯光(guang)(guang)(guang)(guang)束轉(zhuan)換為均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平頂(ding)輪廓，從(cong)而在整個視(shi)野(ye)中(zhong)實現(xian)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)照(zhao)(zhao)明。所(suo)產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平場照(zhao)(zhao)明具有(you)高(gao)(gao)(gao)空(kong)間相(xiang)干性、wu與(yu)倫bi的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)學性能(neng)和 > 95% 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)(gao)(gao)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)性。分(fen)(fen)子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)均(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)勻(yun)激發(fa)和zui小的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)圖像重疊(die) (5%) 可(ke)以(yi)(yi)保證讓您(nin)wan全滿(man)意。

下圖顯示了熒光顯微(wei)鏡(jing)的工作原理(li)和一般結構。

熒光顯(xian)微鏡的工作原理(li)

熒光顯微鏡應用

基于(yu)激光(guang)(guang)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微鏡(jing)內的(de)(de)定量分(fen)析可(ke)(ke)能會因(yin)高斯(si)光(guang)(guang)束(shu)輪廓產(chan)生的(de)(de)不(bu)均(jun)(jun)(jun)勻(yun) 照(zhao)(zhao)明(ming)而變得(de)(de)復(fu)雜。光(guang)(guang)源和照(zhao)(zhao)明(ming)光(guang)(guang)學等因(yin)素會影響均(jun)(jun)(jun)勻(yun)性。當要(yao)檢查(cha)大視野 (FOV)時，這(zhe)些功(gong)能尤(you)其具(ju)有(you)挑戰性。測量圖(tu)(tu)像(xiang)由圖(tu)(tu)像(xiang)網(wang)格在熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微鏡(jing)中(zhong)生成(cheng)。以邊(bian)緣(yuan)(yuan)重疊(die)的(de)(de)方式獲取單個(ge)圖(tu)(tu)像(xiang)，并且(qie)可(ke)(ke)以在后處(chu)理中(zhong)組(zu)合它們(men)。如果照(zhao)(zhao)明(ming)不(bu)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)，zui終圖(tu)(tu)像(xiang)的(de)(de)每個(ge)單獨圖(tu)(tu)像(xiang)周圍都會有(you)變暗(an)的(de)(de)邊(bian)緣(yuan)(yuan) - 細(xi)胞和組(zu)織樣本的(de)(de)測量變得(de)(de)不(bu)可(ke)(ke)靠(kao)。光(guang)(guang)照(zhao)(zhao)不(bu)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)的(de)(de)另一個(ge)缺點(dian)：分(fen)子(zi)激活不(bu)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)。那些靠(kao)近光(guang)(guang)束(shu)中(zhong)心的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)比邊(bian)緣(yuan)(yuan)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)更多。位于(yu)奧蘭多的(de)(de)中(zhong)佛羅里達大學光(guang)(guang)學與(yu)光(guang)(guang)子(zi)學院(yuan)的(de)(de)一個(ge)研(yan)究團隊通過(guo)將aphericon 的(de)(de)光(guang)(guang)束(shu)整形器(qi) a|TopShape 和 a|BeamExpander 集(ji)成(cheng)到顯(xian)微鏡(jing)裝置中(zhong)，從而克服(fu)了這(zhe)些問(wen)題。平場照(zhao)(zhao)明(ming) (FFI) 設置將高斯(si)光(guang)(guang)束(shu)塑造成(cheng)統一的(de)(de)平頂輪廓。a|TopShape 對入射激光(guang)(guang)束(shu)大小的(de)(de)變化具(ju)有(you)ji高的(de)(de)容忍(ren)度(du) (± 10 %)，并且(qie)以消(xiao)色差方式運行。非常好的(de)(de)光(guang)(guang)學性能（均(jun)(jun)(jun)勻(yun)性 > 95%）可(ke)(ke)實(shi)現(xian)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)照(zhao)(zhao)明(ming)，從而激活分(fen)子(zi)。此(ci)外，FFI 設置可(ke)(ke)實(shi)現(xian)無邊(bian)界拼接成(cheng)像(xiang)，圖(tu)(tu)像(xiang)重疊(die)zui小 (5%)。

定量熒光成像(xiang)的平場照(zhao)明

項目介紹：

高斯(si)輪(lun)廓的(de)(de)(de)不(bu)均(jun)勻(yun)光(guang)(guang)(guang)照使得基于(yu)激光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)寬視場熒(ying)光(guang)(guang)(guang)顯微鏡的(de)(de)(de)定量分析具有很高的(de)(de)(de)挑戰性。許多因(yin)素，包括光(guang)(guang)(guang)源和照明(ming)光(guang)(guang)(guang)學有助于(yu)均(jun)勻(yun)性。當需要幾百微米或毫米尺(chi)度(du)的(de)(de)(de)大視場時，這些特(te)性尤(you)其困難(nan)。獲得一個(ge)圖(tu)像(xiang)網格，使邊界(jie)重疊，并在后處理中將圖(tu)像(xiang)拼接在一起。如(ru)果光(guang)(guang)(guang)照不(bu)均(jun)勻(yun)，zui終拼接的(de)(de)(de)圖(tu)像(xiang)在每個(ge)單獨(du)的(de)(de)(de)圖(tu)像(xiang)周圍都有暗淡的(de)(de)(de)邊界(jie)。因(yin)此，細胞和組織樣本(ben)的(de)(de)(de)測量是不(bu)可靠的(de)(de)(de)。非均(jun)勻(yun)光(guang)(guang)(guang)照的(de)(de)(de)另一個(ge)缺點是分子的(de)(de)(de)不(bu)均(jun)勻(yun)激活。那(nei)些zui靠近光(guang)(guang)(guang)束中心的(de)(de)(de)人(ren)比那(nei)些靠近邊緣(yuan)的(de)(de)(de)人(ren)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)更強烈。

項目實施：

來自(zi)美國佛(fo)羅里達(da)州奧蘭多市中(zhong)佛(fo)羅里達(da)大學(xue)光(guang)學(xue)與光(guang)子學(xue)學(xue)院的(de)一(yi)個研(yan)究團隊，在他(ta)們的(de)顯(xian)微鏡(jing)設置中(zhong)使用非球(qiu)面 TopShape 和(he)(he) BeamExpander 時，可(ke)以克服這(zhe)些(xie)問題(b)，這(zhe)兩個都(dou)是由非球(qiu)面組(zu)成(cheng)的(de)非常(chang)(chang)緊湊和(he)(he)高(gao)精度的(de)折(zhe)光(guang)光(guang)學(xue)組(zu)件。因此(ci)，他(ta)們能夠呈現平場照(zhao)(zhao)明(ming)(FFI)，其中(zhong)高(gao)斯光(guang)束(shu)(shu)被塑造成(cheng)一(yi)個均勻(yun)的(de)平頂輪廓(kuo)(a)。光(guang)束(shu)(shu)整形(xing)裝置非常(chang)(chang)容(rong)忍入射激光(guang)束(shu)(shu)的(de)大小變化(hua)，接受±10%，同時也是消(xiao)色差的(de)(e)。FFI 的(de)工作(zuo)距離(li)(f)長(chang)，空間相干性(xing)高(gao)，可(ke)以在多色單分子成(cheng)像中(zhong)實現均勻(yun)的(de) epi1 和(he)(he) TIRF2 照(zhao)(zhao)明(ming)。所使用的(de)光(guang)學(xue)器件具有吳與倫bi的(de)光(guang)學(xue)性(xing)能，均勻(yun)性(xing)> 95%，允許均勻(yun)的(de)照(zhao)(zhao)明(ming)(c & d)，從而均勻(yun)地激活(huo)分子。此(ci)外(wai)，FFI 實現了zui小圖(tu)像重疊(5%)的(de)無界縫合成(cheng)像。

說明: 1,外延照明模(mo)式是(shi)指從(cong)樣品的一(yi)側進行照明和檢測(ce);

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