在過去的 20 年里，遠場(chang)光學(xue)(xue)(xue)顯微鏡(jing)已(yi)經(jing)跨越(yue)了以阿貝衍射(she)極限(xian)為代表(biao)的一度難以逾越(yue)的分辨(bian)率(lv)障礙 ，開發多種成(cheng)功(gong)(gong)的方(fang)(fang)法(fa)，如受激發射(she)損耗(STED) 、單分子(zi)定位方(fang)(fang)法(fa)(PALM 和(he) STORM) ，結構照明顯微術(SIM)和(he)超分辨(bian)率(lv)光學(xue)(xue)(xue)波動成(cheng)像(xiang)(SOFI)，這(zhe)要(yao)歸(gui)功(gong)(gong)于圖像(xiang)傳感器技術的改(gai)進以及單分子(zi)光譜學(xue)(xue)(xue)的巨大進步。

在(zai)這里，我們提出了一(yi)種新的(de)顯微技術，它(ta)利用(yong) SPAD23陣(zhen)列探測器的(de)超(chao)高(gao)時間分(fen)(fen)辨率(lv)(lv)來測量熒光(guang)波(bo)動(dong)引起的(de)相關(guan)性。在(zai) ISM 架構中(zhong)測量的(de)這種相關(guan)性，然(ran)后被(bei)用(yong)作具(ju)有高(gao)達(da) 4倍增(zeng)(zeng)強(qiang)(qiang)橫(heng)向分(fen)(fen)辨率(lv)(lv)和增(zeng)(zeng)強(qiang)(qiang)軸向分(fen)(fen)辨率(lv)(lv)的(de)超(chao)分(fen)(fen)辨率(lv)(lv)圖(tu)像(xiang)(xiang)的(de)對(dui)比度。僅用(yong)幾毫秒的(de)像(xiang)(xiang)素駐(zhu)留時間就可以獲(huo)得(de)高(gao)信(xin)噪比的(de)超(chao)分(fen)(fen)辨率(lv)(lv)圖(tu)像(xiang)(xiang)。

單光子探測器陣(zhen)列SPAD23技術源于代爾夫特理工大學和洛桑聯邦理工學院 7 年的研究工作和 6 項du特技術。它是由23個(ge)六角形封裝的單光子雪崩二(er)極(ji)管組成的探測器陣列(SPADs)，具有更高(gao)的靈敏度(du)和更低的噪聲。這款單光子探測器陣列SPAD23在其寬(kuan)探測譜段(duan)內擁有>50%的探測效(xiao)率，<100cps的暗(an)計數(shu)水平，且因其du特的半導體工藝及設計實現了qian所wei有的填充因子＞80%。這款帶有時間標(biao)記功能(neng)（Time Tagging）的SPAD23整體尺寸只有xin用卡大小，是熒光顯微(wei)和量子信息領(ling)域(yu)的理想探測工具。

得益于SPAD23單光子陣列探測器的優異性能，在與共聚焦顯微鏡搭配使用的過程中，增加了光的收集，最終獲得了更(geng)清晰、更(geng)明(ming)亮的圖像，其中還(huan)包含有(you)關潛在分子功能、相互作用和環境(jing)的功能信(xin)息。

下圖(tu)提(ti)出了一種超分辨光(guang)(guang)學起(qi)伏圖(tu)像(xiang)掃描顯(xian)微術的方案(an)；設置在標準共焦顯(xian)微鏡的圖(tu)像(xiang)平面中的針孔和單像(xiang)素檢(jian)測器被(bei)替換為 23 像(xiang)素的 SPAD 陣(zhen)列，SPAD23單光(guang)(guang)子陣(zhen)列探測器，增加了光(guang)(guang)線收集(ji)，提(ti)高了成像(xiang)速度，減少了背景噪音，能(neng)夠在共聚焦顯(xian)微鏡中實現波動(dong)對比度的超分辨率。

當掃描樣品臺時，每個(ge)(ge)光子的(de)檢測(ce)時間記錄在(zai)相(xiang)連的(de) FPGA 電(dian)路中，并(bing)以數字形(xing)式(shi)存(cun)儲(chu)。然后分(fen)(fen)析該數據，為(wei)陣列中的(de)每個(ge)(ge)像(xiang)素(su)(su)對產生(sheng)第(di)二個(ge)(ge)相(xiang)關(guan)(guan)圖像(xiang)，產生(sheng) 232 個(ge)(ge)分(fen)(fen)辨率增(zeng)強為(wei) 2 的(de)相(xiang)關(guan)(guan)圖像(xiang)。如下圖b所示(shi)分(fen)(fen)辨率的(de)提高可歸因(yin)(yin)于兩個(ge)(ge)因(yin)(yin)素(su)(su)。首(shou)先(xian)，如在(zai) ISM 中一(yi)樣，每個(ge)(ge)小探測(ce)器的(de)點擴展函數(PSF)是激發和(he)其(qi)探測(ce) PSF 的(de)乘(cheng)積。此外，從兩個(ge)(ge)這(zhe)樣的(de) ISM PSFs 相(xiang)乘(cheng)得到的(de)相(xiang)關(guan)(guan)對比度實現了進一(yi)步(bu)的(de)變窄。在(zai)對圖像(xiang)進行適(shi)當的(de)移動以使其(qi)相(xiang)互(hu)重(zhong)疊之后，這(zhe)一(yi)過程(cheng)被稱為(wei)像(xiang)素(su)(su)重(zhong)新分(fen)(fen)配，我們在(zai)空間頻率域(yu)中應(ying)用傅立葉重(zhong)新加權濾波的(de)最后階段。理論上(shang)，最終 SOFISM 圖像(xiang)的(de) PSF 具(ju)有(you)超過衍(yan)射(she)極限 4 倍的(de)橫向分(fen)(fen)辨率增(zeng)強。

圖C 展示了(le)(le) SOFISM，對相(xiang)對稀疏的(de)(de)(de)單(dan)個 CdSe/CdS/ZnS核(he)/殼/殼量(liang)子點(QDs)的(de)(de)(de)樣(yang)品進行成(cheng)像(xiang)(xiang)。除了(le)(le)由于衍射(she)造成(cheng)的(de)(de)(de)模糊之(zhi)外(wai)，標(biao)準的(de)(de)(de)共焦圖像(xiang)(xiang)(CLSM)包含(han)大量(liang)的(de)(de)(de)噪聲，這(zhe)(zhe)是由于量(liang)子點的(de)(de)(de)發射(she)強度在亮和(he)暗狀態(閃爍)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)波動(dong)造成(cheng)的(de)(de)(de)。生成(cheng)標(biao)準 ISM 圖像(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)分(fen)辨率提高了(le)(le) 2 倍(bei)(bei)，同(tong)時噪聲水平明顯降低(di)，通(tong)(tong)過像(xiang)(xiang)素(su)(su)重新(xin)分(fen)配(pei)達(da)到(dao)平均水平。或者，通(tong)(tong)過計(ji)算熒光(guang)信(xin)號的(de)(de)(de)二階相(xiang)關(guan)矩陣，然后重復 ISM 過程的(de)(de)(de)剩余部分(fen)(像(xiang)(xiang)素(su)(su)重新(xin)分(fen)配(pei)和(he)傅立葉重新(xin)加權),產生分(fen)辨率提高 2.5 倍(bei)(bei)的(de)(de)(de)更清晰的(de)(de)(de)圖像(xiang)(xiang)。我們注意到(dao)，這(zhe)(zhe)個數字低(di)于理論預測(ce)的(de)(de)(de)數字，可能是由于探(tan)測(ce)器的(de)(de)(de)有(you)限尺寸(cun)、樣(yang)品振動(dong)和(he)其他技術方面的(de)(de)(de)原因。

最后，還(huan)可(ke)(ke)以生(sheng)成互相關階數高于 2 的(de)(de)(de)(de)(de) SOFISM 圖(tu)像；上圖(tu)C 展示了來(lai)自相同(tong)場景的(de)(de)(de)(de)(de) 4 階相關圖(tu)像，產生(sheng)橫(heng)向分(fen)辨(bian)(bian)率(lv)(lv)的(de)(de)(de)(de)(de) 4倍(bei)增 強。 在類似的(de)(de)(de)(de)(de)實驗條件下，盡(jin)管(guan)檢測(ce)方(fang)案有些麻煩，SOFISM 已經被證(zheng)明(ming)在軸向分(fen)辨(bian)(bian)率(lv)(lv)上提(ti)供(gong)(gong)(gong)了 2 倍(bei)的(de)(de)(de)(de)(de)改(gai)進，雖然(ran)一些成熟的(de)(de)(de)(de)(de)超分(fen)辨(bian)(bian)率(lv)(lv)技術(shu)已經被生(sheng)命科學(xue)研究團(tuan)體采用并取得了巨大(da)成功，但是 SPAD 陣列技術(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)最新進展為(wei)可(ke)(ke)以針(zhen)對特定(ding)需求(qiu)提(ti)供(gong)(gong)(gong)超分(fen)辨(bian)(bian)率(lv)(lv)解決方(fang)案。SOFISM 可(ke)(ke)以提(ti)供(gong)(gong)(gong)一種(zhong)實驗上簡單的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法，在合理的(de)(de)(de)(de)(de)曝光時間內提(ti)供(gong)(gong)(gong)顯著的(de)(de)(de)(de)(de) 3D 分(fen)辨(bian)(bian)率(lv)(lv)增強，并且沒有顯著的(de)(de)(de)(de)(de)實驗復雜性。

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