科普-超分辨顯微成像之多波長合束激光器

曾經有(you)這樣一個傳言，“中(zhong)國(guo)的*長城是(shi)太空中(zhong)能看到的地球(qiu)上的人工(gong)建筑”，這讓我們中(zhong)國(guo)人自豪(hao)無比。但(dan)神舟載人飛船上天后，包(bao)括楊利偉(wei)、劉洋在內的眾多航天員都曾說(shuo)過，“沒有(you)看到長城”，這是(shi)為何呢？

長(chang)城

其(qi)實人(ren)眼的(de)(de)分辨率很有(you)限，只(zhi)有(you)0.3角(jiao)分左(zuo)右(you)，即便(bian)在二百公里左(zuo)右(you)的(de)(de)近地(di)點軌道高度(du)(du)上，不(bu)考(kao)慮(lv)任何天氣因素，人(ren)眼至(zhi)多看(kan)(kan)清17米(mi)以上的(de)(de)目標，因此對于(yu)(yu)寬度(du)(du)不(bu)過七八(ba)米(mi)的(de)(de)長(chang)城，確實有(you)心(xin)無力了(le)。當然了(le)，若是不(bu)考(kao)慮(lv)“看(kan)(kan)清”，而只(zhi)是“看(kan)(kan)到(dao)(dao)”，那么只(zhi)要在夜(ye)間將長(chang)城照的(de)(de)燈火(huo)通明，太空中的(de)(de)宇航員就有(you)可能“看(kan)(kan)到(dao)(dao)”長(chang)城了(le)。不(bu)過這就像遠遠看(kan)(kan)到(dao)(dao)商店的(de)(de)霓虹燈箱，卻看(kan)(kan)不(bu)清楚燈箱的(de)(de)字一樣，不(bu)屬于(yu)(yu)我們此處討論的(de)(de)范(fan)疇。

200公里左右太空看長城效果(guo)示意圖

成像系統的分辨率之所以會受到限制，除了光學元件存在像差之外，更重要的原因是光波存在衍射效應，使得一個理想無限小的點物體發射的光波通過系統成像后，由于成像系統口徑有限，物體光的高頻成分被阻擋，終參與成像的只有物體光波的低頻成分（因此傳統成像系統本質上相當于一個低通濾波器），使得終的像不再是一個無限小的理想點，而成為了一個彌散的亮斑，稱為“艾里斑”。
 

因此當(dang)兩(liang)個點(dian)物體距離(li)較近時(shi)，它們(men)通過成(cheng)像系統后形成(cheng)的(de)(de)兩(liang)個艾(ai)里(li)斑就會重疊到(dao)一(yi)起無法分(fen)(fen)辨，兩(liang)個物點(dian)恰能(neng)分(fen)(fen)辨的(de)(de)距離(li)就是極限(xian)分(fen)(fen)辨距離(li)，對應的(de)(de)張角即為(wei)極限(xian)分(fen)(fen)辨角，這就是的(de)(de)“瑞利(li)判據”。科(ke)學家發現(xian)，通常(chang)情況(kuang)下該極限(xian)分(fen)(fen)辨率與光的(de)(de)波長(chang)（λ）、成(cheng)像系統口徑（D）和數(shu)值孔徑（NA）等(deng)參數(shu)有關。

瑞利判據

為了獲得更好的成像效果，科學家嘗試了許許多多的方法：在光刻系統中使用越來越短的光波（如目前因特爾等芯片企業已開始使用極紫外光），擴大成像系統口徑（如天文望遠鏡口徑已達到10米以上），增加成像系統數值孔徑（如顯微成像系統使用浸油等方式獲得更大的NA）等，但這些方法都未能擺脫理論極限的影響。
 

“衍射極(ji)限”仿佛(fo)是一片籠(long)罩在頭頂的(de)陰霾，成為了(le)看似堅不可摧的(de)障礙。為了(le)能夠打(da)破這個枷鎖和(he)桎梏(gu)，實(shi)現超分辨成像，科學家們真是腦(nao)洞大開，展現出了(le)無窮的(de)智慧(hui)。

讓我們(men)看(kan)看(kan)科學家們(men)通過(guo)哪些方法打破桎梏：
結構(gou)光照明顯微(SIM)
普通光學顯微鏡的成像過程可以通過點擴展函數進行描述，通過對點擴展函數進行傅里葉變換，可獲得顯微系統的光學傳遞函數。由于衍射極限的存在，光學傳遞函數限制了通過顯微系統的信息量，只允許低頻信息通過系統，濾除代表細節的高頻信息，即限制了系統的分辨率。
 

結構光照明顯微鏡實現超分辨的原理，就是利用特定結構的照明光 在成像過程把位于光學傳遞函數范圍外的一部分信息轉移到范圍內，利用特定算法將范圍內的高頻信息移動到原始位置，從而擴展通過顯微系統的樣品頻域信息，使得重構圖像的分辨率超越衍射極限的限制。
 

對(dui)于光(guang)學(xue)顯(xian)(xian)微(wei)鏡(jing)系(xi)統，光(guang)學(xue)傳遞函數的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)三維結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)是(shi)圓環結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)，在零頻位置存在凹陷。凹陷帶(dai)來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)后果就(jiu)(jiu)是(shi)CCD 上(shang)記錄的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)息(xi)(xi)不僅包(bao)含物(wu)鏡(jing)焦平(ping)面上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)信(xin)息(xi)(xi)，同(tong)時(shi)包(bao)含焦平(ping)面外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)信(xin)息(xi)(xi)。由于受(shou)到焦平(ping)面外的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)息(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)干擾，常規熒光(guang)顯(xian)(xian)微(wei)鏡(jing)無法獲得(de)層(ceng)析圖像。三維結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)光(guang)照明顯(xian)(xian)微(wei)鏡(jing)提高(gao)分辨(bian)率、獲得(de)層(ceng)析圖像的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)原理，就(jiu)(jiu)是(shi)利用特(te)定結(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)照明光(guang)來獲得(de)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)頻信(xin)息(xi)(xi)，采用特(te)定算法在橫向和(he)縱向上(shang)擴展樣(yang)品(pin)頻域信(xin)息(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)同(tong)時(shi)彌補凹陷帶(dai)來的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響。

飽(bao)和結(jie)構照明顯微鏡(SSIM)的原理

法國(guo)OXXIUS多波長(chang)合束激光器應用(yong)在Nikon顯微(wei)鏡

受(shou)激發射(she)損耗(hao)顯(xian)微(wei)（STED）

在STED顯(xian)微(wei)術中(zhong)，有效熒(ying)光(guang)(guang)(guang)發(fa)光(guang)(guang)(guang)面(mian)積的(de)(de)(de)減(jian)小是通過受(shou)(shou)激(ji)(ji)(ji)發(fa)射效應來實現的(de)(de)(de)。一個(ge)典型的(de)(de)(de)STED顯(xian)微(wei)系(xi)統中(zhong)需要兩束照明光(guang)(guang)(guang)，其(qi)中(zhong)一束為激(ji)(ji)(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)，另(ling)外(wai)一束為損耗(hao)光(guang)(guang)(guang)。當激(ji)(ji)(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)照射使(shi)得其(qi)衍射斑(ban)范圍(wei)(wei)內的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)分(fen)子(zi)被激(ji)(ji)(ji)發(fa)，其(qi)中(zhong)的(de)(de)(de) 電子(zi)躍遷到(dao)激(ji)(ji)(ji)發(fa)態(tai)后，損耗(hao)光(guang)(guang)(guang)使(shi)得部分(fen)處于(yu)激(ji)(ji)(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)斑(ban)外(wai)圍(wei)(wei)的(de)(de)(de)電子(zi)以受(shou)(shou)激(ji)(ji)(ji)發(fa)射的(de)(de)(de)方式(shi)回到(dao)基態(tai)，其(qi)余位于(yu)激(ji)(ji)(ji)發(fa)光(guang)(guang)(guang)斑(ban)中(zhong)心的(de)(de)(de)被激(ji)(ji)(ji)發(fa)電子(zi)則(ze)不受(shou)(shou)損耗(hao)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)影響(xiang)，繼續以自發(fa)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)(de)方式(shi)回到(dao)基態(tai)。

由于在受(shou)激發(fa)(fa)射(she)過程中(zhong)所發(fa)(fa)出(chu)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)和(he)自(zi)發(fa)(fa)熒(ying)光(guang)(guang)的(de)(de)波長及傳(chuan)播方向均(jun)不同，因(yin)此真正(zheng)被探測器所接受(shou)到的(de)(de)光(guang)(guang)子均(jun)是由位于激發(fa)(fa)光(guang)(guang)斑(ban)中(zhong)心部(bu)分(fen)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)樣品通(tong)過自(zi)發(fa)(fa)熒(ying)光(guang)(guang)方式(shi)產生的(de)(de)。由此，有效熒(ying)光(guang)(guang)的(de)(de)發(fa)(fa)光(guang)(guang)面積得以減(jian)小，從而提高(gao)了系(xi)統的(de)(de)分(fen)辨率。STED顯(xian)微(wei)術能實現超分(fen)辨的(de)(de)另一個關(guan)鍵(jian)在于受(shou)激發(fa)(fa)射(she)與自(zi)發(fa)(fa)熒(ying)光(guang)(guang)相(xiang)互(hu)競爭中(zhong)的(de)(de)非線性效應。

當(dang)損(sun)耗光(guang)(guang)照(zhao)射在激(ji)(ji)發光(guang)(guang)斑的(de)(de)邊緣位置(zhi)使(shi)得該處(chu)樣品中的(de)(de)電(dian)子(zi)發生受(shou)激(ji)(ji)發射作用時，部分(fen)(fen)電(dian)子(zi)不可(ke)避免地仍然會(hui)以(yi)自(zi)發熒光(guang)(guang)的(de)(de)方(fang)(fang)式(shi)回到基(ji)態(tai)。然而當(dang)損(sun)耗光(guang)(guang)的(de)(de)強度超(chao)過某(mou)一閾值之后，受(shou)激(ji)(ji)發射過程將出現飽和(he)，此(ci)時以(yi)受(shou)激(ji)(ji)發射方(fang)(fang)式(shi)回到基(ji)態(tai)的(de)(de)電(dian)子(zi)將占(zhan)絕大(da)多(duo)數(shu)，而以(yi)自(zi)發熒光(guang)(guang)方(fang)(fang)式(shi)回到基(ji)態(tai)的(de)(de)電(dian)子(zi)則(ze)可(ke)以(yi)忽略不計。因此(ci)，通過增(zeng)大(da)損(sun)耗光(guang)(guang)的(de)(de)強度，使(shi)得激(ji)(ji)發光(guang)(guang)斑范(fan)圍內(nei)更多(duo)范(fan)圍的(de)(de)自(zi)發熒光(guang)(guang)被抑制，可(ke)以(yi)提高STED顯(xian)微術的(de)(de)分(fen)(fen)辨率(lv)。

受激發射損耗(STED)顯微的原理

法(fa)國OXXIUS公司多波長合(he)束激光(guang)器

STORM和PALM超分(fen)辨顯微成(cheng)像技術

STORM技(ji)術中，使用Cy3和Cy5分(fen)(fen)子對(dui)(dui)作(zuo)為熒(ying)(ying)光標記實現超分(fen)(fen)辨成像，因為不同(tong)波長(chang)光可以(yi)(yi)(yi)控制Cy5在熒(ying)(ying)光激(ji)(ji)發(fa)態(tai)和暗(an)態(tai)之(zhi)間切換(huan)，例如紅(hong)色633nm激(ji)(ji)光可以(yi)(yi)(yi)激(ji)(ji)活Cy5發(fa)射(she)(she)熒(ying)(ying)光，同(tong)時長(chang)時間照射(she)(she)可以(yi)(yi)(yi)將Cy5分(fen)(fen)子轉(zhuan)換(huan)成暗(an)態(tai)不發(fa)光。之(zhi)后用綠(lv)色的(de)(de)(de)532nm激(ji)(ji)光照射(she)(she)Cy5分(fen)(fen)子時，可以(yi)(yi)(yi)將其從暗(an)態(tai)轉(zhuan)換(huan)成熒(ying)(ying)光態(tai)，而此過程的(de)(de)(de)長(chang)短依賴于第(di)二個熒(ying)(ying)光分(fen)(fen)子Cy3和Cy5之(zhi)間的(de)(de)(de)距離(li)，因此，當Cy3和Cy5交聯成分(fen)(fen)子對(dui)(dui)時，具備了特定的(de)(de)(de)激(ji)(ji)發(fa)光轉(zhuan)換(huan)熒(ying)(ying)光分(fen)(fen)子發(fa)射(she)(she)波長(chang)的(de)(de)(de)特性。

在(zai)顯微觀(guan)察前，首先將待測觀(guan)察樣(yang)(yang)品用(yong)染劑染色，將Cy3和(he)Cy5分(fen)(fen)子(zi)對(dui)膠聯到特異(yi)的蛋白(bai)質抗體上，就可以用(yong)抗體來標記細胞(bao)的內(nei)源蛋白(bai)，然(ran)后用(yong)波長(chang)為(wei)633nm的紅光(guang)長(chang)時間照射樣(yang)(yang)品使Cy5發(fa)(fa)射熒(ying)(ying)(ying)光(guang)后全(quan)部轉化(hua)為(wei)暗(an)態(tai)，采用(yong)波長(chang)為(wei)532nm的綠光(guang)激發(fa)(fa)Cy3，從而使Cy5處于熒(ying)(ying)(ying)光(guang)態(tai)。激發(fa)(fa)過程中應使532nm綠光(guang)強(qiang)度足(zu)夠低，以保證在(zai)衍射極(ji)限范圍內(nei)至多(duo)只有一(yi)個(ge)Cy5熒(ying)(ying)(ying)光(guang)分(fen)(fen)子(zi)被(bei)激活至熒(ying)(ying)(ying)光(guang)態(tai)。而后，用(yong)波長(chang)為(wei)633nm的紅色激光(guang)照射待觀(guan)察樣(yang)(yang)品，使處于熒(ying)(ying)(ying)光(guang)態(tai)的Cy5分(fen)(fen)子(zi)發(fa)(fa)射熒(ying)(ying)(ying)光(guang)。通過電子(zi)相機讀取熒(ying)(ying)(ying)光(guang)圖(tu)(tu)像，采用(yong)函數擬合的方法(fa)對(dui)圖(tu)(tu)像進行(xing)處理，進而確定(ding)每個(ge)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)點(dian)的中心位(wei)置。經過足(zu)夠多(duo)次數循環后對(dui)獲(huo)得的熒(ying)(ying)(ying)光(guang)點(dian)位(wei)置進行(xing)疊加，終得到超(chao)分(fen)(fen)辨(bian)顯微圖(tu)(tu)像。

STORM技術中熒光開關原(yuan)理(li)圖

PALM技術中(zhong)，使用(yong)(yong)GFP突變體(ti)作為光活(huo)(huo)化蛋(dan)白(bai)（PA-GFP）來標記(ji)靶蛋(dan)白(bai)，并在細胞中(zhong)表達。用(yong)(yong)405nm激(ji)(ji)光器低能量照射細胞表面，一次僅激(ji)(ji)活(huo)(huo)出(chu)稀疏分(fen)布的幾個(ge)熒光分(fen)子(zi)，然(ran)后用(yong)(yong)561nm激(ji)(ji)光激(ji)(ji)發得(de)到熒光，通過高斯擬合(he)來定(ding)位這些熒光分(fen)子(zi)，在確(que)定(ding)這些分(fen)子(zi)的位置后，長時間使用(yong)(yong)561nm激(ji)(ji)光來漂白(bai)這些已經定(ding)位正確(que)的熒光分(fen)子(zi)后，使他們不能夠被下一輪的激(ji)(ji)光再激(ji)(ji)活(huo)(huo)出(chu)來。

再分(fen)(fen)(fen)別用(yong)405nm和(he)561nm激(ji)光來(lai)激(ji)活、激(ji)發和(he)漂白其他熒光分(fen)(fen)(fen)子，多次成(cheng)(cheng)像后，將這些分(fen)(fen)(fen)子的熒光圖像合成(cheng)(cheng)到一張圖上，得到了比傳(chuan)統光學顯(xian)微鏡(jing)至少高10倍以上的分(fen)(fen)(fen)辨率。PALM顯(xian)微鏡(jing)的分(fen)(fen)(fen)辨率僅(jin)僅(jin)受限于單分(fen)(fen)(fen)子成(cheng)(cheng)像的定位精(jing)度(du)，理論上來(lai)說(shuo)可以達(da)到1nm的數量級(ji)。PALM的成(cheng)(cheng)像方法只(zhi)能用(yong)來(lai)觀察外源表(biao)達(da)的蛋(dan)白質，而對(dui)于分(fen)(fen)(fen)辨細胞內源蛋(dan)白質的定位無能為(wei)力。

STROM與PALM的(de)(de)基(ji)本原理一致(zhi)，區別在于(yu)STORM使用的(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)開關(guan)基(ji)團(tuan)是有(you)機熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)分(fen)(fen)子對(dui)，而PALM使用的(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)開關(guan)基(ji)團(tuan)是熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)蛋白分(fen)(fen)子，由于(yu)STORM具有(you)對(dui)細胞內源性(xing)生物分(fen)(fen)子成像的(de)(de)優(you)勢(shi)，目前STORM在活細胞等生物體(ti)系的(de)(de)應用更加廣泛。在空間(jian)分(fen)(fen)辨率(lv)上，STORM可(ke)(ke)以達到(dao)10-20nm，PALM可(ke)(ke)以達到(dao)20-30nm；在時間(jian)分(fen)(fen)辨率(lv)上，STORM可(ke)(ke)以達到(dao)1s，而PALM約為(wei)30s。

STORM與常規顯微成像(xiang)方法(fa)對細胞內微管成像(xiang)效果對比
 

什(shen)么是多波長合束激光器？

合(he)束(shu)激光器就是將多個波長光合(he)束(shu)到一起輸出(chu)，它把合(he)束(shu)/分束(shu)、透鏡、整形器件(jian)等全部集成并做了(le)穩(wen)固性(xing)的(de)設計，各波長獨立控制。可(ke)以(yi)讓(rang)科研工作(zuo)者(zhe)或工程師們專心于試驗部分而不是做復雜的(de)光路(lu)調節

傳(chuan)統合束光路

OXXIUS合(he)束激光器內部(bu)光路設計

OXXIUS合束激(ji)光器都有(you)啥干貨？

多8波長輸出~緊湊合理的尺寸~高穩定輸出功率~高光束質量~高速調制功能~強大智能性….
L4Cc是(shi)一(yi)款緊(jin)湊(cou)型多波(bo)長(chang)合束(shu)激(ji)(ji)光器（通(tong)用(yong)型激(ji)(ji)光引擎），它可(ke)將(jiang)8個不(bu)(bu)同波(bo)長(chang)的激(ji)(ji)光耦合到一(yi)根單模或保(bao)偏光纖(xian)之中輸出(chu)，能(neng)同時(shi)或單獨(du)對每一(yi)路激(ji)(ji)光進行控(kong)制(zhi)，單波(bo)長(chang)功率可(ke)達300mW。此外OXXIUS可(ke)根據(ju)客(ke)戶不(bu)(bu)同的要求進行量身定(ding)制(zhi)化的服務。同時(shi)我(wo)們具有(you)遠程診斷修復和自我(wo)保(bao)護功能(neng)，同時(shi)具有(you)通(tong)過USB和RS232接口(kou)進行軟件控(kong)制(zhi)。激(ji)(ji)光器可(ke)進行高速模擬調制(zhi)或TTL調制(zhi)。

產(chan)品特點：
客戶可以自由選擇合束激光的數量（2個到 8個波(bo)長(chang)可選）
自由空間光輸出/各種光纖耦合輸出可選；
單光路或多光路輸出
智能性強（遠程診斷修復和自我保護功能）；
軟件控制（通過USB和RS232接口）
高穩定性，光束質量高，噪聲低；
百MHZ的TTL調制功能和模擬調制；
結構緊湊，堅固耐用；
可根據客戶的要求定制，不收取定制費；
高性價比;

主要(yao)應用：超分辨率成像、共聚焦顯微鏡、熒光激發、流式細胞儀、SPIM、FRAP、TIRF……
 

典型(xing)波(bo)長(chang)參數：

OXXIUS合束激光器家族部分(fen)解決方(fang)案(an)：

（單光(guang)路輸(shu)出）                                      （雙光(guang)路輸(shu)出）

（8波(bo)長四光路輸出）                       （6波(bo)長可插拔(ba)光纖輸出）

OXXIUS公司其它(ta)激光器: